不同微藻破碎方法的比較研究

不同微藻破碎方法的比較研究

現(xiàn)在，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大約3萬個海生細(xì)胞藻類?，F(xiàn)在，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大約3萬個品種，占波羅的海物種的40%左右。由于其特殊的生長環(huán)境和海洋食物鏈的基礎(chǔ)，微藻已成為過濾生物活性物質(zhì)的來源。據(jù)越來越多的研究，微藻中含有各種特殊的生物活性物質(zhì)，這已經(jīng)成為世界各國的焦點。這些富有成效的活動是如何有效分解細(xì)胞中的這些富有成效物質(zhì)的一個重要問題。采用超過20000Hz的聲波對細(xì)胞破碎稱為超聲波破碎,屬于機械破碎的范圍.許多學(xué)者采用超聲波破碎植物細(xì)胞,研究破碎率與活性物質(zhì)釋放的關(guān)系,表明在超聲處理過程中,不僅保持酶、生物堿、維生素等物質(zhì)的生物活性,而且產(chǎn)率也大幅度的提高.牛波等在20℃條件下分別采用不同頻率的超聲波處理鹽藻,通過顯微鏡記數(shù)觀察得到鹽藻的破碎率可達(dá)87%,使β-胡蘿卜素能夠快速、高效地進入提取介質(zhì),避免目的產(chǎn)物的失活.反復(fù)凍融是一種非機械破碎方法,具有方便,不受外源性雜質(zhì)污染的特點,也被廣泛采用.本試驗采用這兩種方法破碎17種微藻,以尋找適合不同藻的破碎方法和條件,為篩選和有效提取胞內(nèi)的抗菌活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1藻種和儀器扁藻(Platymonassubcordiformis);金藻3011(lsochrysisgalbanaParke3011);牟氏角毛藻(Chaetocorerosmuelleri);繭形藻(Entomoneissp.Ehrenberg);小球藻(Chlorellasaccharophila);金藻8701(IsochrysisgalbanaParke8701);藍(lán)隱藻(Chroomonassp);三角褐指藻(Phaeodactylum);纖細(xì)角毛藻(Chaetocerosgracilis);甲藻(Zooxanthellamicroadriatica);極小海鏈藻(ThalassiosiraminimaGaarder);球等鞭金藻(Isochrysisgalbanasp);紫球藻(Porphyridiumcruentum);叉鞭金藻(Dicraterialsp.);針桿(SynedraEhrenbergsp);衣藻(Chlamydomonasuva-maris);這些微藻藻種由青島海洋大學(xué)提供.SXJ-2型顯微鏡,日本松下電器公司;SB-JS-2型潔凈工作臺,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HWS24型電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;XB-K-25型血球計數(shù)板,上海醫(yī)科大學(xué)科宇科技開發(fā)公司;LGJ-10型冷凍離心機,北京四環(huán)科學(xué)儀器廠.配置培養(yǎng)液的無機鹽為市購分析純.微藻是在消毒的人工海水中添加NaNO374.8mg/L;NaH2PO44.4mg/L;Na2SiO3·9H2O11mg/L;FeC6H5O7·5H203.9g/L;ZnSO4·4H2023mg/L;MnCl2·4H2O178mg/L;CoC12·6H2O12mg/L;Na2EDTA4.35g/L;CuSO4·5H2O10mg/L;Na2MoO4·2H2O7.3mg/L;VB120.5mg/L;VB1100mg/L的F/2培養(yǎng)基上以10%的接種量接種,溫度(25±1)℃,明/暗為12h:12h,光強為4000Lx的環(huán)境中培養(yǎng),每天搖動2～3次,15d后離心收集藻體細(xì)胞,PBS洗滌兩次后,制成密度為106個/mL的待處理藻液,分別進行凍融和超聲波破碎處理.1.4細(xì)胞破碎處理(1)超聲破碎處理:取待處理藻液20mL,在冰浴,超聲功率400W條件下超聲處理,以破碎前后顯微鏡下觀察完整細(xì)胞的個數(shù)計算細(xì)胞破碎率,每個條件平行計數(shù)4次.(2)凍融破碎處理:將待處理藻液-20℃溫度下冷凍,40℃溫水浴中融解5min,反復(fù)2次,以破碎前后顯微鏡下觀察完整細(xì)胞的個數(shù)計算細(xì)胞破碎率,每個條件平行計數(shù)4次.1.5抗菌活性選用S.aureus作為指示菌,選用經(jīng)不同破碎方法的樣品,采用瓊脂擴散法檢測其抗菌活性.具體操作:滅菌濾紙片(Φ9mm),含有萃取物或溶劑DMSO添加到瓊脂板上,分別為處理組或?qū)φ?37℃培養(yǎng)24h后,測定其抑菌圈的大小.所有的實驗均作3個平行.2結(jié)果2.1藻體超聲處理后的敏感性17種微藻液冰浴超聲處理,在不同的時間檢測藻細(xì)胞的破碎率,結(jié)果見表1.從表1中可以看出,實驗所使用的17種微藻,超聲處理12min,均能達(dá)到90%以上的破碎效果.同時也發(fā)現(xiàn)不同的藻,對超聲的敏感性不同,如牟氏角毛藻、甲藻超聲處理僅需0.7min,其破碎率就達(dá)到95%,而對于小球藻、衣藻和桿狀藻,其處理時間需要12min以上才能達(dá)到90%以上的破碎率.表明不同藻種本身的結(jié)構(gòu)特性決定了對超聲的敏感性.2.2不同種類微藻的細(xì)胞破碎率表2為反復(fù)凍融法對細(xì)胞破碎率的影響.反復(fù)凍融使細(xì)胞破碎的原理是由于直接將藻液置于-20℃的低溫環(huán)境中,細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中的絕大多數(shù)水形成冰晶,冰晶的形成產(chǎn)生了膨脹壓,導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生機械損傷,同時未發(fā)生凍結(jié)的胞內(nèi)殘存液,由于在凍結(jié)過程中冰晶的析出致使溶質(zhì)濃縮,電解質(zhì)升高、滲透壓改變、pH改變、蛋白變性等,而溶解又會使細(xì)胞發(fā)生溶脹,最終使細(xì)胞破碎和死亡.從表2中可以看出:17種微藻經(jīng)過2次凍融處理后,細(xì)胞的破碎率在30%～99%.其中10種微藻的破碎率在95%以上,4種微藻在60%～80%,而對于紫球藻、小球藻和扁藻,則細(xì)胞的破碎率小于40%.2.3藻細(xì)胞破碎方法的確定超聲波是一種彈性機械振動波,是聽覺閾以外的振動,它產(chǎn)生強烈振動,高速度、強烈的空化效應(yīng),攪拌作用,因此能破壞細(xì)胞的完整性,使細(xì)胞內(nèi)的活性組分滲透到胞外,以提高有效成分的提出率.反復(fù)凍融是借助于冰晶在胞內(nèi)外的分布不均和冰晶的成長對細(xì)胞所造成的機械傷.本實驗通過對一定濃度的微藻用不同的有機溶劑分別萃取兩種不同方法破碎的藻液,用瓊脂雙擴散法測定抗菌活性,檢驗發(fā)現(xiàn)以下8種藻有不同的抗金黃色葡萄球菌的作用.對其不同的破碎方法和抗菌活性檢測結(jié)果見表3.從表3可看出,提高細(xì)胞的破碎率在不同程度上增加了藻粗提液的抗菌活性.等鞭金藻8701和藍(lán)隱藻采用超聲破碎,破碎率從40%升至85%,抑菌圈直徑分別增加了3mm和2mm,而相應(yīng)的用反復(fù)凍融法破碎效果不明顯.對于三角褐脂藻比較適合反復(fù)凍融法,抑菌圈直徑從8mm增加至11mm,抑菌效果提高了18%.從活性物質(zhì)的檢測發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的充分破碎有利于活性物質(zhì)的提取和釋放.3反復(fù)凍融特性與藻細(xì)胞破碎能力的關(guān)系藻種的不同主要表現(xiàn)在色素的種類、貯藏物質(zhì)的性質(zhì)、細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu),鞭毛的數(shù)目和位置,以及細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)的不同.表4列出了實驗藻種的分類及其特性.從表4看出,細(xì)胞壁中的纖維素組分可能與細(xì)胞的抗冷性相關(guān).細(xì)胞壁中含有纖維素的藻種,如扁藻、紫球藻、小球藻,對反復(fù)凍融有耐受力,這三種微藻經(jīng)過2次操作后,只有30%～40%的破碎率,而其他的微藻,破碎率均在60%以上.小球藻不僅具有抗凍融能力,而且具有較強的抗超聲能力,這可能與小球藻細(xì)胞壁中含有孢粉質(zhì)類似物(一種類胡蘿卜素衍生物的多聚物,常出現(xiàn)在高等植物花粉粒的細(xì)胞壁中)有關(guān).藻的生長環(huán)境也會對反復(fù)凍融的耐受力有影響.球等鞭金藻(IsochrysisgalbanaParke)是貽貝、牡蠣等海洋經(jīng)濟動物幼蟲的理想餌料,本文選用同種但生長環(huán)境不同的金藻,其最適培養(yǎng)溫度從高到低的順序依次為球等邊金藻,球等鞭金藻3011和球等鞭金藻8701,比較它們在反復(fù)凍融(99%,80%和60%)的細(xì)胞破碎率發(fā)現(xiàn):耐低溫的品系的破碎率明顯小于耐受高溫的品系.青島海洋大學(xué)的宮相忠等研究比較了金藻8701和3011兩個品系與清除活性氧相關(guān)的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性變化時發(fā)現(xiàn),品系抗脅迫能力的強與弱,與SOD酶活的高低有關(guān).說明低溫品系抗脅迫能力強的原因可能與活性氧清除能力有關(guān).超聲波對細(xì)胞破碎的效率與細(xì)胞種類、時間、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān).裴海燕等在研究藻細(xì)胞破碎對釋放有機物特性的研究中發(fā)現(xiàn),超聲處理確實增加了藻細(xì)胞內(nèi)的有機物的釋放.孫利芹等研究了超聲對紫球藻破碎效果,結(jié)果表明超聲破碎方法比反復(fù)凍融有效,當(dāng)輸出功率150W,處理時間20min破碎率達(dá)到85%.這一結(jié)果與我們的結(jié)果一致.而對于其他藻細(xì)胞破碎的研究尚未見報道.另外,超聲處理會產(chǎn)生局部高溫現(xiàn)象,因此在超聲處理時一定要在冰浴條件下進行,同時超聲模