高效液相色譜法測定山核桃樹葉中球松素查耳酮的含量

高效液相色譜法測定山核桃樹葉中球松素查耳酮的含量

山核桃是核桃科的一種山核桃植物。主要分布在浙江和安徽交界處的天力地區(qū)，特別是臨安地區(qū)和彰化，具有明顯的區(qū)域分布特征。山核桃具有廣泛的藥理作用,山核桃樹皮具有清熱解毒、抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤的作用,山核桃外果皮具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌消炎的作用,山核桃葉片提取物有很好的抑菌作用,對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌、黃曲霉菌、青霉菌和黑曲霉菌均有效。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)山核桃葉提取物有抑制SGC-7901細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)該腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。因此,筆者經(jīng)過對山核桃葉提取物進(jìn)行分離,并首次從中得到球松素查兒酮(DHMC)。目前有關(guān)DHMC藥理作用的研究很少,僅少量文獻(xiàn)報(bào)道DHMC具有選擇性抗利什曼原蟲的作用,經(jīng)過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),DHMC不僅對腫瘤細(xì)胞有較好的抑制作用,而且還具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及舒張血管等作用,可用于進(jìn)一步開發(fā)防治動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的藥物。目前已報(bào)道的含有DHMC的物質(zhì)很少,且含量不高。本試驗(yàn)建立了HPLC測定山核桃樹葉中DHMC含量的方法,為以后進(jìn)一步開發(fā)DHMC的藥用價(jià)值提供參考。1超聲清洗器儀器:Dionex高效液相色譜儀(美國戴安公司)、萬分之一精密電子天平(AR2130OhausCorp.PineBrook,NJ,USA)、KQ-3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,功率(150W,頻率40kHz)。試藥:色譜級(jí)甲醇(臨海市浙東特種試劑廠)、甲醇(杭州大方化學(xué)試劑廠)、水為雙蒸水;山核桃葉(采自浙江臨安,經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳錫林副教授鑒定為山核桃(CaryacathayensisSarg.)的樹葉;對照品:DHMC(實(shí)驗(yàn)室自制,經(jīng)NMR鑒定其結(jié)構(gòu),HPLC峰面積歸一法檢測含量為99.4%)。2方法和結(jié)果2.1溶液制備2.1.1山核桃葉供試品溶液的制備取適量山核桃葉粉碎,過40目篩,稱取粉末約0.25g,精密稱定,置于25ml容量瓶中,精密加入25ml甲醇,稱定重量,超聲處理30min,取出待冷卻后,再次稱定重量,用溶劑補(bǔ)足減失重量,取續(xù)濾液0.5ml,定容至10ml容量瓶中,搖勻,過0.45μm濾膜,即得山核桃葉供試品溶液。2.1.2對照品貯備溶液的制備精密稱取減壓干燥的DHMC對照品5mg,置10ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得0.5mg/ml的對照品貯備溶液。2.1.3對照品溶液的制備精密量取對照品貯備液2.0ml,置50ml容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,從中吸取5ml,用甲醇定容至25ml,搖勻,即得0.004mg/ml的對照品溶液。2.2dhmc的測定色譜柱為KromasilC18(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-水(65∶35,V/V),流速為1.0ml/min,檢測波長為342nm,柱溫為30℃,進(jìn)樣量為10μl。在此條件下DHMC達(dá)到基線分離。結(jié)果見圖1。2.3方法研究2.3.1dhmc進(jìn)樣量的線性關(guān)系精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的對照品貯備液1ml,置50ml容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,分別精密吸取2、4、6、8、10μl,注入色譜儀進(jìn)行測定,記錄色譜圖,以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y),求得回歸方程為:Y=7.8868X-0.0409(r=0.9996)。結(jié)果表明,DHMC進(jìn)樣量在0.02~0.10μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。2.3.2色譜峰面積的測定精密吸取0.004mg/mlDHMC對照品溶液10μl,注入色譜儀,重復(fù)進(jìn)樣6次,測定DHMC的色譜峰面積值,求得峰面積的RSD為1.1%(n=6)。2.3.3進(jìn)樣峰面積測定精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液10μl,注入色譜儀,按0、1、2、3、4、5h間隔進(jìn)樣,測得DHMC的色譜峰面積,求得峰面積的RSD為0.9%(n=6)。結(jié)果表明,供試品溶液在室溫條件下5h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.3.4dhmc重現(xiàn)性測定取同一批藥材,按“2.1.1”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液并依法測定DHMC的色譜峰面積,求得峰面積RSD為0.9%(n=6),結(jié)果表明本法重現(xiàn)性良好。2.3.5加樣回收率試驗(yàn)取已知DHMC含量的山核桃葉粉碎,過40目篩,稱取藥材粉末約0.125g,精密稱定,研細(xì),共稱取6份,分別精密加入對照品貯備液(0.5mg/ml)1.6、1.6、2.0、2.0、2.4、2.4ml,再按“2.1.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,并依法測定,記錄色譜峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算出DHMC的回收率分別為99.47%、99.71%、102.5%、101.4%、104.3%、102.3%,平均回收率為101.6%,RSD=1.8%(n=6)。2.4dhmc含量測定取“2.1.3”項(xiàng)下的對照品溶液和“2.1.1”項(xiàng)下的山核桃葉供試品溶液各10μl進(jìn)樣測定,按上述色譜條件測定峰面積,外標(biāo)法計(jì)算含量,結(jié)果山核桃葉中DHMC的含量為7.916mg/g,達(dá)0.79%。3超聲提取和水浴回流提取提取流動(dòng)相的選擇試驗(yàn)過程中采用了100%、80%和60%的甲醇溶液提取,三者均可得到較好的分離效果,且測得的結(jié)果無明顯差異,鑒于便捷性和穩(wěn)定性考慮,采用100%甲醇為提取溶劑;在提取方法的選擇上,采取超聲提取和水浴回流提取兩種方法作對比,二者測得的結(jié)果無明顯差異,從簡便和節(jié)能上考慮,采用了超聲處理法提取;在流動(dòng)相選擇上,對兩種洗脫系統(tǒng)進(jìn)行比較,即乙腈-水(65∶35)、甲醇-水(65∶35),結(jié)果顯示采用甲醇-水(65∶35)為流動(dòng)相,峰形與分離效果最好,故選擇