慢病毒載體的功能與改性

慢病毒載體的功能與改性

目前，反向重組中的病毒載體已被用作基因治療和其他研究領域的常用基因轉移工具。慢病毒為一類逆轉錄病毒的總稱,由慢病毒改建而來的載體系統(tǒng)以其高效而穩(wěn)定的基因轉移效率成為近來研究者們的常用選擇。與其他逆轉錄病毒載體相比,慢病毒載體主要有以下幾個優(yōu)點:其一:慢病毒載體既可以轉染處于有絲分裂活躍期的細胞,又可以轉染分裂緩慢及處于分裂終末期的細胞,包括造血干細胞,神經干細胞,處于分化終末的神經元,肝實質細胞等;其二:由慢病毒載體攜帶整合入宿主基因組的目的基因對轉錄沉默作用有較強的抵抗能力,在體外培養(yǎng)細胞實驗和體內移植實驗中,由慢病毒載體攜帶導入的目的基因可以在宿主細胞中得到長期而穩(wěn)定的表達;其三:慢病毒載體可以兼容多個轉錄啟動子,包括細胞特異性啟動子和在基因組中普遍存在的管家基因的啟動子;其四:經過改建后的慢病毒載體可以容納約10kb左右的外源基因,因此大多數(shù)的cDNA都能被克隆入慢病毒載體。慢病毒載體的上述優(yōu)點使其成為體內和體外基因轉移的一種有效工具。1慢病毒載體基因整合原理慢病毒載體根據(jù)其來源不同,主要有以下幾種類型:HIV-1型(humanimmunodeficiencyvirustype1)載體系統(tǒng),HIV-2型(humanimmunodeficiencyvirustype2)載體系統(tǒng),猿類免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyvirus,SIV),貓免疫缺陷病毒(felinesimmunodeficiencyvirus,FIV)等。其中HIV-1型載體系統(tǒng)研究得最為廣泛和深入。HIV-I型慢病毒載體構建過程與其他逆轉錄病毒載體的構建原則相似,在研究應用過程中,HIV-I型慢病毒載體通過改建逐步去除了野生型病毒基因組中的致病基因,并完全去除了3′端LTR中的U3序列,使LTR區(qū)的轉錄激活能力下降,成功構建了自我滅活型載體系統(tǒng)(self-inactivationvectors,SIN)。這一系統(tǒng)保留了野生型病毒(圖1)基因的順式作用元件LTR,包裝信號(φ),及Rev基因的反應元件。去除了vif,vpr,vpu,nef等致病基因,保證了載體的生物安全性。將編碼病毒衣殼和包膜結構的基因分別克隆于另外兩個質粒中,通過三個質粒共同轉染包裝細胞產生完整的病毒顆粒。也就是說,慢病毒載體系統(tǒng)主要由三種包含不同結構的質粒構成,分別是轉移質粒(transfervectors),輔助質粒(helperplasmids),包膜表達質粒(envelopexpressionplasmids)。結構如圖2。其中,轉移質粒除包含我們感興趣的外源基因外,同時還保留了病毒的LTR區(qū)和其他對病毒的整合復制起重要作用的元件。其中LTR區(qū)包含了慢病毒的啟動子、增強子、包裝信號、整合位點(attachmentsite,Att)等結構。包裝序列能夠使識別病毒RNA將其衣殼化并裝配到病毒顆粒中,Att位點使病毒基因可以整合入宿主基因。同時轉移質粒中還加入了內部啟動子驅動外源基因轉錄。輔助質粒整合進入包裝細胞后表達蛋白多聚體gag,編碼病毒的衣殼蛋白及病毒的其他模序結構(matrixstructure),同時表達蛋白pol,pol蛋白具有逆轉錄酶及整合酶的活性,負責對病毒載體基因的結構元件進行切割,促使載體基因整合入宿主細胞基因組中。包膜質粒中用口腔炎皰疹病毒的包膜蛋白基因(VSV-G)取代了HIV-1型病毒的env基因,由于VSV-G受體廣泛存在于多種細胞表面,使慢病毒載體的宿主細胞傾向性大大增加。2現(xiàn)階段，緩慢病毒載體的設計正在開展為進一步提高載體的應用范圍和生物安全性,現(xiàn)階段研究者對載體的結構作了進一步的改進,主要包含以下幾個方面。2.1最佳載體的研發(fā)由于SIN型慢病毒載體去除了大部分的HIV-IU3區(qū)自身的啟動子,為了驅動外源基因的轉錄,一些實驗室在U3區(qū)插入了外源性的啟動元件代替了U3區(qū)本身的啟動結構。這種改建的成功使得在U3區(qū)插入的外源啟動子和外源基因可以有效表達,也使得在慢病毒載體中同時表達兩種外源基因成為可能。因此,現(xiàn)階段應用的慢病毒載體可以同時克隆入外源基因,抗生素篩選基因以及熒光標記。這一方面的改進對于體外細胞水平的基因表達研究和在體的基因治療研究都具有重要意義。另外,設計者們也通過這種改建認識到可以通過更多地去除U3區(qū)的部分序列來提高載體的生物安全性。一些實驗室將loxP位點插入到了3′LTR的U3區(qū),載體完成逆轉錄和整合的過程后,loxP位點也會通過復制出現(xiàn)在5′LTR區(qū),這樣載體中的轉入基因就會嵌入在兩端的loxP位點之間,這種設計一方面可以通過加入cre使兩端的loxP位點發(fā)生環(huán)化從而使轉入的外源基因沉默,提供了一種外源基因條件性表達的可能,同時也為轉入外源基因可能對組織或細胞產生副作用提供了安全保障。2.2逆轉錄相關基因表達增加由于病毒載體的基因組結構是隨機整合入宿主基因組中的,整合部位宿主基因的調控元件會對整合入的外源基因表達起抑止作用。這種作用也被稱為位置效應(positionaleffect)。引發(fā)這種效應的原因最初被認為是cpG胞嘧啶核苷二聚體的甲基化以及組蛋白脫乙酰作用所引起的染色體凝聚。后來在在利用逆轉錄病毒對干細胞進行基因轉移的研究中發(fā)現(xiàn),不同的細胞中可能存在一種細胞特異性的轉錄沉默因子,這種因子在甲基化作用發(fā)生之前使基因表達處于靜息狀態(tài)。目前研究者主要通過以下幾種途徑來削弱這種效應。一是刪除已知的逆轉錄病毒沉默元件。最近有研究表明,應用HIV-1型慢病毒載體轉染鼠類細胞,轉錄沉默作用僅發(fā)生在非SIN型載體系統(tǒng)中,分析原因可能是非SIN型載體仍然保留有LTR區(qū)的轉錄起始元件,而這種元件會對整個載體基因在宿主基因中的轉錄起始起干擾作用。二是加入正向調控元件來增強轉移基因的表達。目前這些正向調控元件主要包括局部調控元件(localcontrolregion,LCR),染色質絕緣體(chromatininsulator),模序結合位點(matrixattachmentsites)。如DNaseI高敏感性位點(highpersensetivesites,HS)是位于β-球蛋白基因簇上游的LCR,這一區(qū)域游離于核小體之外,對反式作用元件的親和性較高,并可以協(xié)調位點獨立性表達和復制依賴性表達的關系。有研究證實將這一區(qū)域插入慢病毒載體可以提高β-球蛋白基因在轉基因鼠中的表達。插入染色質絕緣體(chromatininsulator)也可以提高目的基因的表達。模序結合位點是介導單個染色質莖環(huán)結構與類似蛋白質的模序黏附結合的區(qū)域。將這一序列插入載體明顯提高了轉染效率和轉入基因的表達時間。這些調控元件的發(fā)現(xiàn)為構建慢病毒載體,使目的基因在靶細胞中持續(xù)高效表達提供了依據(jù)。2.3通過外源基因引導基因型的基因表達病毒載體攜帶的外源基因轉入宿主細胞后是否能夠表達還與啟動外源基因的啟動子及宿主細胞的類型均有關系,一般類型的慢病毒載體都選用管家基因的啟動子來啟動外源基因以保證其有效轉錄。研究者由此想到了應用靶細胞特異性表達基因的啟動子作為載體外源基因的啟動序列,從而使轉入的外源基因只在特定類型的細胞中表達。有研究報道,利用星形膠質細胞的特異性表達蛋白GFAP的啟動子構建的慢病毒載體在注入動物模型的受損腦區(qū)后,其攜帶的外源基因特異性地在星形膠質細胞中表達,并且外源基因的表達水平可以伴隨內源性GFAP基因的激活而得到調節(jié)。這一技術也被應用于生產不同組織特異性表達GFP的轉基因動物,其方法是利用含不同組織特異表達蛋白啟動子的慢病毒載體轉染胚胎細胞,如果胚胎發(fā)育成功,特定的組織細胞會呈GFP陽性。應用組織特異性的啟動子和增強子來驅動慢病毒載體中的外源基因能夠使其在特定的組織細胞中表達,這一進展為慢病毒載體介導的基因靶向性治療提供了理論基礎。2.4tet-oh轉錄調節(jié)系統(tǒng)如何使慢病毒載體攜帶的外源基因根據(jù)機體的需要進行有效調節(jié)也是保證基因治療的有效性和安全性的重要問題。目前應用最多、前景最好的是四環(huán)素調節(jié)系統(tǒng),即tet-on及tet-off系統(tǒng)。這一系統(tǒng)是根據(jù)大腸埃希氏菌屬TN10的四環(huán)素抗性操縱子的結構特點構建的,這一抗性操縱子包含一個四環(huán)素抑制蛋白(TetR)、一個特異性的DNA結合位點及四環(huán)素操縱序列(TetO)。無四環(huán)素存在的條件下,TetR呈二聚體狀態(tài)并與TetO結合。四環(huán)素(tetracycline)或四環(huán)素類似物——強力霉素(doxycycline)可以與TetR結合使其構象發(fā)生改變,從而導致TetR與TetO分離。后來發(fā)現(xiàn),TetR存在一種突變體結構,在這種突變體中決定TetR空間構象的四個核心蛋白發(fā)生了突變,形成了一種反式的空間構象,即當dox存在時,TetR呈二聚體結構結合于TetO上阻礙了下游基因的轉錄。利用四環(huán)素原核操縱將單純皰疹病毒的轉錄激活域(VP16)與TetR或TetR的突變體融合分別組成四環(huán)素反式激活因子(tetracyclineresponsiveactivator,tTA)和rtTA(reversetetracyclineresponsivetransactivator)。為了在哺乳動物細胞中表達,研究者將CMV啟動子與TetO重復序列融和,與tTA結合構成了Tet-off轉錄調節(jié)系統(tǒng),與rtTA結合構成了tet-on轉錄調節(jié)系統(tǒng)。由于tet-off系統(tǒng)需要長期給予強力霉素來維持外源基因的表達,這對于終身的基因治療不是一個理想的選擇。同時,tet-off系統(tǒng)的誘導啟動需要通過藥理作用清除強力霉素,這一過程較tet-on系統(tǒng)的誘導過程要緩慢。因此,tet-on轉錄調節(jié)系統(tǒng)在目前基因治療領域的應用更為廣泛。目前應用的Tet-on基因調節(jié)系統(tǒng)多分別構建于兩個質粒中,其中一個含有由外源啟動子驅動的rtTA,另一個質粒中含有TRE及受其調控的外源基因。二者通過共同轉染同一細胞來發(fā)揮TRE和rtTA間的調控作用,這一過程需要通過兩步篩選來完成,即首先篩選出成功轉染TRE的細胞群,再用含rtTA的質粒來轉染TRE陽性的細胞群,然后通過第二次的分篩篩選出二者都轉染成功的細胞群。這一系統(tǒng)更適合于體外的實驗,在在體實驗中的可控性較差。有研究者正試圖將二者構建于同一載體中。但是,Tet-on系統(tǒng)不足之處在于背景效應的存在,所謂背景效應是指在四環(huán)素不存在的情況下,rtTA也會與TetO結合,這種情況會導致受其調控的蛋白表達量的下降,這對于在低劑量水平發(fā)揮作用的蛋白表達更為不利,如生長因子類蛋白。針對這一問題,有些實驗室正對rtTA作進一步的改進,如經過改建后的反式轉錄激活因子rtTA2s-M26,經過TetR區(qū)的突變和遺傳密碼的優(yōu)勢選擇,以及VP16區(qū)的激活域改建為含12個氨基酸的重復序列,其特異性、穩(wěn)定性、可調性都得到了很大提高。它可以在四環(huán)素濃度較最初的rtTA低10倍的情況下發(fā)揮作用,在四環(huán)素不存在的情況下,沒有背景效應的產生。并且外源基因的表達水平與四環(huán)素的濃度在一定范圍內呈劑量依賴關系,即隨著外源給予四環(huán)素濃度的增加,外源基因的表達量也會相應增加。因此,通過對rtTA的改建,對逆轉錄病毒載體中加入的外源基因表達水平可以進行準確的調節(jié),使載體和外源基因的可控性更強,為慢病毒載體應用于臨床打下了基礎。最新型的四環(huán)素可調控系統(tǒng)與慢病毒載體相結合,使基因的條件性表達和基因敲除都成為可能,為探索基因的功能提供了有利的工具。Szulc等利用KRAB結構域(Kruppel-associatedbox)的結構和功能特點構建了一種新型的TET-on/off調控系統(tǒng)。接近三分之一的參與轉錄調控的鋅指結構中包含KRAB結構域,當DNA與鋅指結構相互作用時,KRAB結構域環(huán)化成為多分子復合體,引發(fā)組蛋白的脫乙酰作用和甲基化,從而導致染色體的變構而抑制轉錄激活。KRAB結構域與tetR結構相融合構成了轉錄激活抑制結構,研究者證實利用這種結構與四環(huán)素操縱子結構相互作用(圖4)在體外細胞培養(yǎng)試驗和在體試驗中都能得到了更為嚴格的基因調控表達效果。3慢病毒載體的安全性分析現(xiàn)階段將目的基因導入靶細胞和組織的方法主要包括真核表達質粒的轉染,和病毒載體介導的基因轉移方法等。其中真核表達質粒的轉染對于分裂增殖比較旺盛的體外培養(yǎng)細胞轉染效果較好,但表達的目的基因常常隨時間的延長而發(fā)生丟失。與真核表達質粒相比,病毒載體介導的基因轉移可以整合入宿主的基因組中,具有更好的穩(wěn)定性。最初研究的鼠干細胞病毒和后來的腺病毒載體在轉染分裂增殖旺盛期的細胞時都取得了較好的效果,但對于分裂增殖緩慢和處于靜息期的細胞基因轉染的效果卻不盡人意。慢病毒載體出現(xiàn)以后,先后在造血干細胞,胚胎干細胞,以及在體的神經膠質細胞,神經元的基因轉移中都取得了成功。隨著慢病毒載體的構建更加完善和基因組學蛋白質組學的進展,基因治療成為一些疾病的最佳選擇。而慢病毒載體的一些生物學特性使許多基因治療的設想具備了可行性。由于慢病毒家族中的HIV-1及其他類型的病毒對人類和動物有極大的危害性,因此慢病毒載體的生物安全性成為阻礙其應用的主要問題。第三代的慢病毒載體雖然已經進一步提高了載體系統(tǒng)的安全性,并且在以前的研究中并沒有在載體生產過程中產生野生型病毒的報道。但要使慢病毒載體系統(tǒng)應用于臨床,還需要從以下幾個方面作出進一步的努力。首先在載體設計過程中應進一步縮短載體及包裝質粒中的病毒編碼序列,這樣可以降低病毒基因重組的幾率,但是載體中的包裝信號和包裝質粒中的gag序列之間的重復不可能完全避免,因此有必要在生產過程中通過長期培養(yǎng)和PCR技術對生產出來的病毒載體進行分析。另外在載體設計時應避免出現(xiàn)潛在的自殺基因,這類基因一旦被激活,會導致靶細胞的死亡。如果慢病毒載體真正應用于臨床,那么機體的免疫系統(tǒng)會引發(fā)針對注入的病毒顆粒的免疫應答,這些病人就可能在HIV抗原檢測中呈陽性結果,導致診斷的混淆和病人心理上的壓力。因此為進一步提高慢病毒載體的生物安全性,應在臨床應用前對其進行多方面的安全檢測和分析。通過以上的介紹,慢病毒載體是理想的真核細胞基因轉移工具,通過對其結構和功能的進一步的完善,在科學研究中有著廣泛的應用前景。慢病毒載體可以轉化處于分裂靜止期和分化終末狀態(tài)的細胞,今后應用在一些可以通過基因治療方式治愈的疾病的實驗和臨床研究中。比如一些神經系統(tǒng)疾病。在神經系統(tǒng)中,絕大多數(shù)的神經元和膠質細胞處于一個相對靜止的時期,其它的逆轉錄病毒載體對于神經系統(tǒng)疾病的基因治療顯得無能為力,而實驗證實,慢病毒載體無論是在體外細胞及組織培養(yǎng)實驗中,還是在在體的基因治療實驗中,對神經元和膠質細胞都具有穩(wěn)定的轉染能力。因此,慢病毒載體為一些神經系統(tǒng)疾病的基因治療帶來了希望。近期的研究表明,由慢病毒載體系統(tǒng)介導的應用GDNF(膠質源性神經營養(yǎng)因子)對帕金森氏病進行基因治療已經在靈