生蒼術(shù)及雜糧蒼術(shù)揮發(fā)油急性毒性的研究

生蒼術(shù)及雜糧蒼術(shù)揮發(fā)油急性毒性的研究

白術(shù)是一種傳統(tǒng)的濕藥。湖北省中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)研究所所長張秀橋教授將其鑒定為菊花植物d（thunb.）的干燥生根，并將其記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》中。范疇較高。它具有性熱、苦、溫、精、脾、胃、肝的功能。具有除濕健脾、防風(fēng)、散寒、明目等功能。生蒼術(shù)燥性偏大,麩炒可緩和其燥性,并可增強(qiáng)健脾和胃作用。蒼術(shù)主要含揮發(fā)油,由一系列的倍半萜、聚乙烯炔類及少量的酚類、有機(jī)酸類等組成。蒼術(shù)揮發(fā)油的主要成分為β-桉葉醇、茅術(shù)醇、蒼術(shù)酮、蒼術(shù)素,具有降血壓、利尿、促進(jìn)胃排空和抗炎等作用。目前,尚沒有關(guān)于麩炒蒼術(shù)揮發(fā)油對小鼠的急性毒性研究報(bào)告,現(xiàn)對蒼術(shù)炮制前后揮發(fā)油進(jìn)行急性毒性的實(shí)驗(yàn)研究,為今后充分研究其藥理作用、臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料表面1.1藥物和試劑蒼術(shù)飲片(武漢市劉天保藥業(yè)飲片廠,批號100501),麩炒蒼術(shù)自制,食用調(diào)和油(武漢益海嘉里糧油工業(yè)有限公司)。1.2實(shí)驗(yàn)動物性別昆明小鼠,體質(zhì)量為(20±2)g,雌雄各半,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供,實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證證號:No.4200499460。2方法2.1揮發(fā)油的提取水蒸氣蒸餾提取法:稱量1000g蒼術(shù)飲片,裝入10000mL水蒸氣蒸餾提取器中,加入6000mL純化水提取,溫度控制在100℃左右,至揮發(fā)油的量不再增加,蒸餾液用乙醚萃取,萃取后再用無水硫酸鈉干燥,過濾,自然揮干,得揮發(fā)油,揮發(fā)油為淡黃色透明油狀物。得到的揮發(fā)油,密封后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩｛煶瓷n術(shù)揮發(fā)油同法平行操作。計(jì)算生蒼術(shù)、麩炒蒼術(shù)揮發(fā)油的得率,分別為7.1%和4.8%。2.2劑量轉(zhuǎn)換方法2.4實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量及結(jié)果分析主要分為5.預(yù)試驗(yàn)前對小鼠進(jìn)行7d的喂養(yǎng)觀察,觀察期內(nèi)小鼠自由采食、飲水。在反復(fù)大跨度摸索劑量范圍的基礎(chǔ)上,再做批量的預(yù)試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)將小鼠隨機(jī)分成6組,每組4只,雌雄各半,各組按等比濃度灌胃給藥,確定試驗(yàn)小鼠0%和100%死亡的劑量范圍。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)所用劑量,按公式求出正式試驗(yàn)的劑量比r。式中:r=相鄰兩組劑量的比值;b=最大劑量;a=最小劑量;n=預(yù)分組數(shù)。正式實(shí)驗(yàn)時將小鼠隨機(jī)分成6組(溶劑對照組及蒼術(shù)揮發(fā)油1,2,3,4,5五個實(shí)驗(yàn)組),每組10只,雌雄各半,組間計(jì)量比值為r,按1∶K(K=1/r)等比稀釋法,配制等比濃度揮發(fā)油藥物,按0.2mL/10g灌胃給藥,觀察記錄各組小鼠死亡數(shù)。給藥后觀察小鼠體質(zhì)量變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、死亡情況及中毒反應(yīng)(中毒反應(yīng)的癥狀、嚴(yán)重程度、起始時間、持續(xù)時間、是否可逆)等,觀察14d。對瀕死及死亡動物及時進(jìn)行尸檢,其他動物在觀察期結(jié)束之后進(jìn)行尸檢,觀察內(nèi)臟器官體積、顏色及質(zhì)地有無改變,若有肉眼可見病變進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。根據(jù)改良寇氏法公式計(jì)算半數(shù)致死量(LD50):LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)];LD50的95%可信限式中:Xm=最大劑量組劑量的對數(shù)值;i=劑間比的對數(shù)值;Σp=各組死亡率之和;p=各組死亡率;q=各組存活率,q=1-p;n=各組動物數(shù);Sx50=logLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤差。3結(jié)果3.1急性毒性試驗(yàn)結(jié)果生蒼術(shù)揮發(fā)油對小鼠急性毒性試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果:初步確定0%和100%死亡劑量分別是1181.7,4545.5mg·kg-1。根據(jù)公式計(jì)算K=0.71。麩炒蒼術(shù)揮發(fā)油對小鼠急性毒性試驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:初步確定0%和100%死亡劑量分別是4083.7,8167.4mg·kg-1。根據(jù)公式計(jì)算K=0.84。生蒼術(shù)及麩炒蒼術(shù)揮發(fā)油對小鼠的急性毒性試驗(yàn):試驗(yàn)結(jié)果見表1~4。由改良寇氏法公式計(jì)算,生蒼術(shù)揮發(fā)油LD50=2454.71mg·kg-1,LD50的95%可信限為2123.24～2837.92mg·kg-1。由改良寇氏法公式計(jì)算,麩炒蒼術(shù)揮發(fā)油LD50=5248.07mg·kg-1,LD50的95%可信限為4677.35～5888.43mg·kg-1。根據(jù)化合物經(jīng)口急性毒性(LD50)分級標(biāo)準(zhǔn),生蒼術(shù)揮發(fā)油分級為低毒;而麩炒蒼術(shù)揮發(fā)油分級為實(shí)際無毒。3.2小鼠急性毒性及剖檢變化實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃生蒼術(shù)及麩炒蒼術(shù)揮發(fā)油后,主要毒性癥狀為:行動遲緩、靜臥、昏睡、呼吸減弱、心率減慢,直至死亡。毒性癥狀的輕重與劑量成正相關(guān)。小鼠死亡開始于給藥后3.5h,大多發(fā)生于給藥后24h以內(nèi)?；謴?fù)期內(nèi)小鼠無異常表現(xiàn)。大部分小鼠死亡時,面部、尾巴發(fā)黑。4h內(nèi)死亡小鼠解剖無明顯的病理變化;延長至48h內(nèi)死亡小鼠剖檢時可見胃部脹大成氣泡,膀胱集尿、膽汁分泌增多、肺充血或淤血;部分小鼠有腸道水腫,甚至胃底和十二指腸出血;晶狀體混濁,其他未見異常。4從藥養(yǎng)監(jiān)測的角度蒼術(shù)經(jīng)麩炒后,揮發(fā)油LD50大幅增加,毒性降低,該結(jié)果與臨床用藥相吻合,說明炮制對蒼術(shù)揮發(fā)油質(zhì)和量產(chǎn)生的影響,直接影響著蒼術(shù)臨床用藥的安全性。有關(guān)蒼術(shù)炮制前后揮發(fā)油化學(xué)成分的變化,已有文獻(xiàn)報(bào)道,蒼術(shù)生品及炮制品中的揮發(fā)油僅有量變而無質(zhì)變,且蒼術(shù)經(jīng)麩炒后揮發(fā)油含量降低較多。生蒼術(shù)中β-桉葉醇為主成分,其次是蒼術(shù)酮、茅術(shù)醇,麩炒蒼術(shù)中茅術(shù)醇為主成分,其次是蒼術(shù)酮、β-桉葉醇。因此,推測蒼術(shù)麩炒后揮發(fā)油毒性的降低不僅與揮發(fā)油量的降低有關(guān),與揮發(fā)油中某些組分含量的降低也有一定的相關(guān)性。蒼術(shù)揮發(fā)油對小鼠機(jī)體的影響,蒼術(shù)中含有的β-桉葉醇、茅術(shù)醇對小鼠有鎮(zhèn)靜作用,抑制小鼠自發(fā)活動,這可能是給小鼠灌服蒼術(shù)揮發(fā)油后中毒時出現(xiàn)活動減少、趴臥、對外界反映降低等臨床癥狀的原因,而膀胱蓄尿可能與蒼術(shù)揮發(fā)油的利尿作用有關(guān)。蒼術(shù)含有的蒼術(shù)素能促進(jìn)膽汁分泌作用,這與解剖時出現(xiàn)的膽汁增多癥狀相符。小量蒼術(shù)揮發(fā)油有抑制心搏、減慢心率及鎮(zhèn)靜作用;大量可致心臟麻痹,使呼吸麻痹而致死。大劑量試驗(yàn)組中小鼠死亡的主要原因可能與其對心血管及呼吸抑制有關(guān),而其具體的毒性成分及中毒機(jī)制尚有待更進(jìn)一步探討。2010年版中國藥典記載臨床上蒼術(shù)處方劑量為3～9g,設(shè)定9g為成人用劑量,標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量成人以60kg計(jì),成人每天的劑量為9×103mg/60kg=150mg·kg-1,小鼠以20g計(jì),由成人換算成小鼠用藥劑量(mg·kg-1)為:小鼠=成人×換算系數(shù)=150mg·kg-1×12.33=1849.5mg·kg-1。單只小鼠生蒼術(shù)揮發(fā)油和麩炒蒼術(shù)揮發(fā)油每天灌胃劑量分別為131.31,88.776mg·kg-1。2.3