水中細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群的同時測定實驗方案 Microsoft Word 文檔

福建醫(yī)科大學(xué)人工湖水體中——細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群數(shù)的檢測實驗方案實驗組員：陳秋香、陳志明、林玲、李淋、管修標(biāo)實驗?zāi)康?．學(xué)習(xí)水樣的采取方法和水樣細(xì)菌總數(shù)測定的方法。2．了解水的平板菌落計數(shù)的原則。3.掌握測定水中大腸菌群數(shù)量的多管發(fā)酵法的原理、操作步驟及方法；4.了解水質(zhì)評價的微生物學(xué)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，明白其應(yīng)用的重要性。二、實驗原理A．水中的細(xì)菌總數(shù)越多，說明水中有機物的含量就越高，水體被污染的程度越重。水中細(xì)菌的種屬繁多，它們對營養(yǎng)和其他生長條件的要求差別很大，不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下，使水中所有的細(xì)菌均能生長繁殖，以一定的培養(yǎng)基平板上生長出來的菌落，計算出來的水中的細(xì)菌的總數(shù)實際上是一種近似值。腸道中的絕大多數(shù)腐生性和致病性的細(xì)菌，可在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進(jìn)行生長。因此應(yīng)用平板菌落計數(shù)技術(shù)來測定水樣中的細(xì)菌總數(shù)基本上能代表水樣中細(xì)菌的數(shù)量。B.總大腸菌群是以E.coli為代表的桿狀、無芽胞、需氧或兼性厭氧、革蘭氏陰性，經(jīng)37℃、24～48h培養(yǎng)，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)CO2可區(qū)別于其他腸道菌，易于測定的一類細(xì)菌。大腸菌群主要包括埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和檸檬酸桿菌屬。這類菌是溫血動物腸道中的正常菌群，常隨動物的糞便污染水源，一個成年人每天排出的糞便中含有（5-100）×三、實驗器材及試劑1.菌落總數(shù)恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸氣鍋、電子天平、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；滅菌的玻璃塞瓶1個，三角燒瓶/燒杯4個，滅菌培養(yǎng)皿9個，1ml移液管6支、10ml2支、試管3支，PH試紙、玻璃棒、記號筆1支,100ml量筒，滴管2支。2.大腸菌群儀器及用具：高壓蒸氣鍋、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡（載玻片一盒、擦鏡紙、雙層瓶含香柏油和二甲苯）打火機、酒精燈、接種環(huán)、無菌1ml吸管8支、10ml4支，發(fā)酵用試管10支、杜氏小管10個，燒杯/蒸餾瓶5個，100ml量筒、滴管若干，PH試紙、玻璃棒、電子臺秤。培養(yǎng)基：乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基，三倍濃乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，革蘭染色劑，生理鹽水等。四、操作步驟1．水樣的采取取距湖水面10-15cm深層水樣，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出，最好立即檢查，否則需放入冰箱中保存。2．細(xì)菌總數(shù)測定（a）取加入9ml水的滅菌試管。取1ml水樣注入第一管9ml滅菌水內(nèi)，搖勻，再自第一管取1ml至下一管滅菌水內(nèi)，如此稀釋到第三管，稀釋度分別為10-1、10-2與10-3。一般中等污穢水樣，取10-1、10-2、10-3三個連續(xù)稀釋度，污穢嚴(yán)重的取10-2、10-3、10-4三個連續(xù)稀釋度。（b）自最后一個稀釋度的試管中各取1ml稀釋水加入空的滅菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。（c）各傾注15ml已溶化并冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即放在桌上混勻。（d）凝固后倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。3.大腸菌群數(shù)的測定a.初發(fā)酵試驗：分別吸取1mL1:10稀釋水樣、1mL1:100稀釋水樣及1mL水樣，分別注入裝有10mL普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管）。另取10mL水樣，注入裝有5mL3倍濃縮的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管）。混勻后，37℃b.平板分離：經(jīng)24h培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的發(fā)酵管，分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)板上，再于37℃c.復(fù)發(fā)酵試驗：上述涂片鏡檢如為革蘭陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，再接種于普通濃度的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的6支試管中（內(nèi)有倒管）。每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落1～3個，37℃培養(yǎng)24h，試驗結(jié)果若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，即證實有大腸菌群存在。證實有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試驗的陽性管數(shù)查表，即得總大腸菌群水樣五、計算結(jié)果1.湖水中細(xì)菌總數(shù)a.細(xì)菌總數(shù)的菌落計數(shù)方法（1）先計算相同稀釋度的平均菌落數(shù)。若其中一個培養(yǎng)皿有較大片狀菌苔生長時，則不應(yīng)采用，而應(yīng)以無片狀菌苔生長的培養(yǎng)皿作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌苔的大小不到培養(yǎng)皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時，則可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全培養(yǎng)皿的菌落數(shù)，然后再計算該稀釋度的平均菌落數(shù)。（2）首先選擇平均菌落數(shù)在30—300之間的，當(dāng)只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該水樣的細(xì)菌總數(shù)（見表ⅪⅤ-1）。（3）若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)在30—300之間，則應(yīng)按兩者菌落數(shù)以各自稀釋倍數(shù)后的總數(shù)之比（稀釋度高的數(shù)/稀釋度低的數(shù)）來決定。若其值小于2，應(yīng)報告兩個總數(shù)的平均數(shù)（若大于等于2則報告其中較少的菌落總數(shù)）（4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（6）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30—300之間，則以最近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（7）若所以稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。（8）菌落計數(shù)的報告：菌落計數(shù)在100以內(nèi)按實際數(shù)報告，大于100，采用二位數(shù)計數(shù)，在二位數(shù)有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算，為了縮減數(shù)字后面的零數(shù)，也可以用10的指數(shù)來表示。在報告菌落數(shù)為“多不可計”時，應(yīng)注明水樣的稀釋倍數(shù)。六.實驗報告1．細(xì)菌總數(shù)結(jié)果2.大腸菌群數(shù)的測定——根據(jù)實驗的陽性結(jié)果，查表可知。注意事項：1.認(rèn)真配制不同類型的培養(yǎng)基2.檢測中應(yīng)合理控制所加的水樣量。3.在選菌落時認(rèn)真選擇大腸菌群典型菌落。4.操作過程中注意避免污染。設(shè)備及儀器：1.細(xì)菌總數(shù)測定恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸氣鍋、電子天平、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；滅菌的玻璃塞瓶1個，三角燒瓶/燒杯4個，滅菌培養(yǎng)皿9個，無菌1ml吸管6支、10ml2支、試管3支，PH試紙、玻璃棒、記號筆1支,100ml量筒，滴管2支。營養(yǎng)瓊脂200ml成為：蛋白胨2g；牛肉膏0.6g；氯化鈉1g；瓊脂4g；蒸餾水400ml（200ml配置培養(yǎng)基）。2.大腸菌群數(shù)的測定無菌1ml吸管6支、10ml4支，發(fā)酵用試管10支、杜氏小管10個，燒杯/蒸餾瓶5個，100ml量筒、滴管若干，PH試紙、玻璃棒。顯微鏡（載玻片一盒、擦鏡紙、雙層瓶含香柏油和二甲苯）打火機、酒精燈、接種環(huán)，培養(yǎng)皿6個。燒杯/蒸餾瓶5個，試劑瓶若干等。培養(yǎng)基：乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基200ml成分：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，乳糖1g，氯化鈉0.2g，1.6﹪溴甲酚紫乙醇溶液0.2ml，蒸餾水200ml；三倍濃乳糖蛋白胨培養(yǎng)液10ml：蛋白胨0.3g，牛肉膏0.09g（取0.1g），乳糖0.15g，氯化鈉0.15g，1.6﹪溴甲酚紫乙醇溶液0.03ml，蒸餾水10ml。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基100ml成分：蛋白胨1.0g，乳糖1.0g，磷酸氫二鉀0.2g，瓊脂1.7g，2％伊紅水溶液，0.65％美藍(lán)溶液1ml，蒸餾水100ml。革蘭染色所需試劑：（1）結(jié)晶紫染色液10ml成分：將2ml結(jié)晶紫乙醇飽和溶液（稱取0.4—0.8g結(jié)晶紫溶于10ml95﹪乙醇中）和8ml1﹪草酸銨溶液混合、