植物MS組培實驗

1.實驗流程（1） 實驗總流程：MS母液培養(yǎng)基的配置一胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)培養(yǎng)基的配制一胡蘿卜愈傷組織誘導一胡蘿卜愈傷組織的繼代培養(yǎng)一觀察記錄（2） 無菌操作流程：實驗員消毒一實驗室、無菌臺滅菌一實驗器材的滅菌一無菌接種一消毒一實驗臺衛(wèi)生（3） 胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)流程：胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)基的配置一胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)培養(yǎng)基的分裝一胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)培養(yǎng)基滅菌一取材及材料的消毒滅菌一接種與培養(yǎng)（4） 胡蘿卜愈傷組織的繼代培養(yǎng)流程：器械及實驗者的消毒滅菌一剝離愈傷組織誘導培養(yǎng)所得的愈傷組織一胡蘿卜愈傷組織接MS液體成份的配制二、 實驗基本原理MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog（二人縮寫）于1962年為煙草細胞培養(yǎng)設計的，其特點是無機鹽和離子濃度較高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，能滿足植物細胞的營養(yǎng)和生理需要，適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。三、 實驗儀器與與試劑1、 實驗儀器：1000ml/500ml量筒4個、250ml三角瓶（每人2個）、1000ml燒杯或塑料量杯5個、1000ml試劑瓶5個、10只100mL試劑瓶、微波爐、10ml離心管15個、玻璃棒5個、電子天平、稱量紙、卷紙、移液槍（1000|iL、100J1L）、藥勺。2、 實驗試劑：見下述實驗方案中所列。四、 實驗方案與操作1、 大量元素20X母液配制（貯備液I）配制20X（倍）濃度大量元素母液1000mL，按順序充分溶解后再加后一個試劑。KNO3 1900mg/L（1.9g/L）NH4NO3 1650mg/L（1.65g/L）KH2PO4 170mg/L（0.17g/L）MgSO4.7H2O 370mg/L（0.37g/L）CaCL.2HO 440mg/L（0.44g/L）（可單獨瓶配制存放）2 22、 微量元素100X母液（貯備液II）配制：配制100X（倍）濃度大量元素母液1000mL，按順序充分溶解后再加后一個試劑。KI 0.83mg/L（先配母液：0.83gKI溶于8mL水）

H3BO3MnSO4.4HH3BO3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O22.3mg/L（先配母液：0.22g溶于8mL水）8.6mg/L（先配母液：0.86g溶于8mL水）0.25mg/L（先配母液：0.25g溶于8mL水）0.025mg/L（先配母液：0.25g溶于8mL水）0.025mg/L（先配母液：0.25g溶于8mL水）3、鐵鹽100X母液（貯備液III）配制100X（倍）濃度大量元素母液1000mL,按順序充分溶解后再加后一個試劑。Na2EDTA.2炒。 37.3mg/LFeSO4.7H2O 27.8mg/L4、有機成分100X母液（貯備液IV）配制100X（倍）濃度大量元素母液1000mL，按順序充分溶解后再加后一個試劑。肌醇甘氨酸鹽酸硫胺素肌醇甘氨酸鹽酸硫胺素（VB1）鹽酸毗哆醇（VB6）煙酸（VB5）5、植物生長調節(jié)劑的配制:2mg/L（先配母液：0.2g溶于8mL水）

0.1mg/L（先配母液：0.02g溶于8mL水）

0.5mg/L（先配母液：0.05g溶于8mL水）

0.5mg/L（先配母液：0.02g溶于8mL水）6-BA（1mg/mL）：稱10mg6-BA先溶于1mL1M鹽酸充分溶解，再加9mL以蒸餾水，混勻。NAA（1mg/mL）：稱10mgNAA先溶于1mL95%乙醇充分溶解，再加9mL以蒸餾水，混勻。五、實驗注意事項1、 配制貯存母液時，要算好各種成分逐次加入，等第一種成分完全溶解后再加入第二種成分，切忌“一鍋煮”。有機物質配好以后要裝入棕色瓶放入電冰箱內保存，其它三種母液可在常溫下保存但最多不能超過一個月；2、 pH值對培養(yǎng)基的硬度有影響，pH過高培養(yǎng)基變硬，pH過低培養(yǎng)基不能凝固，所以要調整好培養(yǎng)基的pH值MS固體培養(yǎng)基的配制與滅菌二、實驗儀器與試劑1、 實驗儀器高壓滅菌鍋、微波爐、100-200個組培瓶、pH試紙、4個1000mL量筒、4個1000mL塑料量杯、4只玻璃棒、移液槍（1000UL、100^L）、稱量紙、卷紙、電子天平、藥勺2、 實驗試劑：10%NaOH、1MHCl、蔗糖，瓊脂三、實驗操作步驟1、在1000mL塑料量杯中，先加入800mL雙蒸水，再按比例依次加入下列MS成份:大量元素20X母液：微量元素100X母液、鐵鹽100X母液、有機成份100X母液

50mL10mL10mL10mL50mL10mL10mL10mL最后再用約雙蒸水（約120mL）定容到1000mL，充分混勻。靜置30min，觀察無沉淀方可用。2、 稱取并繼續(xù)加入蔗糖30g，瓊脂粉7.5g，混勻。3、 用10%NaOH調節(jié)pH至5.8（用pH試紙或pH計測試），混勻。4、 在微波爐中加熱至溶液均一、穩(wěn)定（要補充蒸發(fā)的水）。5、 將配好的MS培養(yǎng)基趁熱迅速分裝至三角瓶或廣口組培瓶中，每瓶傾倒30ml即可，蓋上瓶蓋（蓋要松點），裝入滅菌筐。6、 放入高壓滅菌鍋121°C，滅菌20min（整個過程約1h左右）。7、 滅菌結束后，立即拿出瓶子，趁熱擰緊每個瓶蓋。8、 置于組培室架子上觀察3-7天，無菌落長出說明良好，供下步組培用。外植體的消毒、接種與培養(yǎng)二、 實驗儀器與試劑1、 實驗材料：新鮮胡蘿卜2、 實驗儀器超凈工作臺、酒精燈、三角瓶、培養(yǎng)皿、鑷子、刀片、剪刀、燒杯、滅菌濾紙、紗布3、 實驗試劑配制好的MS固體培養(yǎng)基、10%次氯酸鈉、無菌水、酒精、NAA，6-BA，NaOH三、 實驗操作方法（一） 外植體的消毒1、 準備工作：提前40min打開超凈工作臺紫外燈殺菌20min，關閉后再打開風機吹20min。坐到超凈臺前，將裝有經(jīng)濕熱滅菌MS固體培養(yǎng)基的三角瓶、配好的消毒液、洗凈瀝干的植物材料置于超凈工作臺上，用70%酒精棉球擦手與器具外壁。2、 外植體的消毒：選取胡蘿卜的韌皮部，用水洗凈。先用70%酒精浸泡15-30S，然后放入6%的次氯酸鈉溶液浸泡20min，進行材料脫毒，然后用無菌水沖洗5次。（二） 外植體的切片與接種用刀片切取紅色韌皮部（不含中央黃色部位）成1cm2大小方塊，厚度約0.2cm。將消毒好的胡蘿卜韌皮部切片，在超凈工作臺上用鑷子接種于已滅菌的含MS固體培養(yǎng)基的三角瓶中，封口。注意規(guī)范操作，防止污染。（三） 外植體的初步培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)基三角瓶置于組培室光照培養(yǎng)架上，先弱光培養(yǎng)1周，再1000-2000lux光照培養(yǎng)數(shù)周，光周期為每天光照14?16h/黑暗8?10h。期間經(jīng)常來觀察，及時清除有污染者和觀察外植體的變化。四、實驗注意事項1、 實驗所使用的器材要嚴格滅菌，注意無菌操作，避免因染菌導致實驗失??；2、 材料脫毒時不要在酒精中停留過長時間，以免材料被殺死；3、 接種后進行培養(yǎng)時，為確保實驗成功，可以首先進行7-10d的暗培養(yǎng)，然后再進行光照培養(yǎng)。實驗影響因素誘導激素在許多植物品種的再生過程中，在分化培養(yǎng)基中添加適量的BA和NAA對分化是非常有利的，但胡蘿卜愈傷組織的再生過程中BA和NAA的作用并不大，成苗非常慢，且再生頻率低，而不添加任何激素的MS和B5基本培養(yǎng)基上，愈傷組織分化率高，且大多通過胚狀體的方式成苗，這是因為胡蘿卜愈傷組織和懸浮細胞系具有較強的胚胎發(fā)生能力，在無激素的培養(yǎng)基上容易成熟和萌發(fā)成苗。從總體看，胡蘿卜愈傷組織出苗的時間相對較長，ABA可促進體細胞胚的成熟，在分化培養(yǎng)基中加入一定濃度的ABA是否可縮短胡蘿卜愈傷組織成苗的時間，無菌操作組培上常用的滅菌方法有物理和化學法。常用的物理方法有：物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、物理除菌、過濾、離心、沉淀等。常用的化學方法：消毒劑、抗菌素滅菌。不同的物品要選用不同的滅菌方法。實驗室中常見儀器設備及其滅菌方法如下：培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法。具體方法如下：壓力在9.8*104-10.8*104Pa，滅菌溫度在121°C，滅菌20-30min。玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌、干熱消毒滅菌。塑料器皿滅菌：多采用高壓蒸汽消毒滅菌金屬用具滅菌：灼燒滅菌。具體方法是：進入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用。接種室殺菌：紫外線照射、空氣消毒滅菌。超凈工作臺：紫外燈照射，70%-75%的酒精擦洗。外植物體滅菌：水沖洗10—20min或更長的時間一70%-75%酒精中浸泡30s-0.1%-0.2%氯化汞液中浸泡10min左右一蒸餾水沖洗4-5次一備用。.注意事項調節(jié)培養(yǎng)基時，理論上應調至5.8為宜，但因培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓滅菌時，蔗糖分解，PH值會有所下降，因此調至6.0可減小誤差。防火。實驗中要經(jīng)常用酒精消毒、用酒精燈燒鑷子、刀具，注意安全。無菌操作。材料經(jīng)HgCl2消毒后，即認為是消毒干凈，此后的操作中的用具要求無菌。為防止染菌，注意：手要用酒精擦干凈；鑷子和刀經(jīng)常在火焰上燒；錐形瓶、手不要放在盛材料的培養(yǎng)皿上方。廢液處理。酒精要回收，放原處；HgCl2有劇毒，小心不要濺出，廢液使用后應按要求放到指定位置。實驗材料大小應適中，不宜太大或太小。實驗中接種過程要在操凈工作臺進行，接種前，實驗所用的所有器械及手均需嚴格消毒滅菌。切胡蘿卜時，下面應墊上濾紙。接種時，動作要輕，力度適中。不要把接種的切塊壓入培養(yǎng)基里面，以致破壞培養(yǎng)基。接種時瓶口應傾斜45度，以免手、鑷子上的贓物容易掉到三角瓶里。操作期間應經(jīng)常用70%—75%的酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應反復在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。滅菌鍋有很多種，實驗室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，使用時要注意以下幾點：（1） 鍋中應放足量的水，以免造成空燒或干燒；（2） 裝鍋時不要過度傾斜，可保持內部有一定的空間，利于蒸汽流動；（3） 增壓前高壓鍋內的空氣必須排凈，否則易影響滅菌效果；