動物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

PAGE2-實(shí)驗(yàn)一：實(shí)驗(yàn)器材準(zhǔn)備【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實(shí)驗(yàn)室工作的主要區(qū)別在于要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。一般標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)室應(yīng)包括配液室、準(zhǔn)備室和培養(yǎng)室。三室既相互連接又相對獨(dú)立，各自完成培養(yǎng)過程中的不同操作?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1\*GB3①培養(yǎng)室的設(shè)置和設(shè)備。=2\*GB3②無菌概念和無菌操作要領(lǐng)。【操作步驟】1．實(shí)驗(yàn)室設(shè)置（1）配液室（2）準(zhǔn)備室（3）培養(yǎng)室培養(yǎng)室內(nèi)要完全密閉，保持恒定的溫度，在設(shè)計上要注意以下幾點(diǎn)：=1\*GB3①培養(yǎng)室的位置最好設(shè)在陰面，陽光不能直接照射的地方，防止室內(nèi)溫度增高。=2\*GB3②天花板的高度不要超過2米，以保證紫外燈的有效殺菌效應(yīng)，=3\*GB3③門一般用拉門，以防止空氣流動。=4\*GB3④天花板、地板和四周墻壁要光滑無死角，要鑲瓷磚或涂油漆，這樣設(shè)計，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墻角堆積灰塵。2．實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備（1）準(zhǔn)備室的設(shè)備=1\*GB3①雙蒸餾水蒸餾器：制備雙蒸水。=2\*GB3②酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。=3\*GB3③干燥箱：洗滌完的玻璃器皿用干燥箱烘干。=4\*GB3④高壓鍋：玻璃器皿、解剖用具、部分液體、塑料器具等滅菌。不同物品其有效滅菌壓力和時間不同。=5\*GB3⑤儲品柜1：放置未消毒物品。=6\*GB3⑥儲品柜2：放置已消毒物品。準(zhǔn)備室注意事項(xiàng)：①預(yù)防蒸餾器被烤干。②勿將酸液濺到衣物或地面。③勿將高壓鍋排氣閥和安全閥堵塞。④已消毒物品應(yīng)與未消毒物品分柜存放。（2）配液室的設(shè)備=1\*GB3①天平（扭力天平和電子天平）：稱量用=2\*GB3②pH計。=3\*GB3③磁力攪拌器。（3）細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)備=1\*GB3①超凈工作臺：超凈工作臺的種類很多，有單面單人、單面雙人、雙面雙人或雙面四人等，其工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)，使通過高效濾氣的空氣，徐徐通過臺面，這樣使工作環(huán)境中具無菌而均勻的空氣。根據(jù)層流方式的不同，超凈工作臺主要分為水平層流式和垂直層流式兩種，基本原理大致相同，都是將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器初濾，由離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過濾器，由此送出的潔凈氣流從一定的均勻的斷面風(fēng)速通過無菌，從而形成無塵無菌的高潔凈度工作環(huán)境。但兩種凈化臺的氣流方向不同。使用超凈工作臺應(yīng)注意的幾點(diǎn)問題：A．凈化工作臺最好安裝在無塵的房間內(nèi)，最好為隔離好的無菌間內(nèi)，以免塵土過多易使濾器阻塞，降低凈化效果，縮短使用壽命。B．新安裝的或長期未使用的工用臺，工作前必須對工作臺和周圍環(huán)境用真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的工具進(jìn)行清潔工作，再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌法進(jìn)行滅菌處理。C．每次使用工作臺時，應(yīng)先用75%酒精擦洗臺面，并提前以30~50min紫外線滅菌燈處理凈化工作區(qū)內(nèi)積累的微生物。在關(guān)閉紫外燈后應(yīng)啟動送風(fēng)機(jī)使之運(yùn)轉(zhuǎn)兩分鐘后再進(jìn)行培養(yǎng)操作。D．凈化工作區(qū)內(nèi)不應(yīng)存放不必要的物品，以保持潔凈氣流型不受干擾。E．一般情況下，高效過濾器三年更換一次。更換高效濾器應(yīng)請專業(yè)人員操作，以保持密封良好。要定期將粗過濾器中的過布（無紡布）拆下清洗，時間應(yīng)根據(jù)環(huán)境潔凈程度而定，通常間隔3~6個月進(jìn)行一次。F．每次使用凈化臺要及時清除工作臺面上的物品，并用灑精擦洗臺面使之始終保持潔凈。=2\*GB3②4℃冰箱和低溫冰箱：=3\*GB3③CO2培養(yǎng)箱：A．一定濃度的CO2對細(xì)胞生長，尤其是原代培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)有促進(jìn)作用（5%）。B．一定濃度的CO2可維持培養(yǎng)液恒定的pH。適用于開放培養(yǎng)，培養(yǎng)箱封口后，可在一般恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，但是采用培養(yǎng)皿或多孔板培養(yǎng)時，則需要高濕度和高CO2含量的空氣。C．它增加了濕度，箱體內(nèi)裝有水浴，可以保證培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度。D．培養(yǎng)箱內(nèi)裝有紫外燈。E．通過氣體流量計可以調(diào)節(jié)CO2和空氣的比例。F．在水中可加入防腐劑（二氧乙酸）?？煞乐挂駽O2培養(yǎng)箱中濕度較高，易長霉菌。=4\*GB3④離心機(jī)：=5\*GB3⑤CO2鋼瓶：=6\*GB3⑥液氮罐：=7\*GB3⑦儲品柜：用來存放雜物=8\*GB3⑧紫外燈：=9\*GB3⑨空氣凈化系統(tǒng)=10\*GB3⑩倒置顯微鏡3．無菌操作（1）無菌室的滅菌：=1\*GB3①紫外燈無人時就要打開；=2\*GB3②進(jìn)無菌室要穿無菌服、戴帽子和口罩；=3\*GB3③每周清洗消毒一次；=4\*GB3④所用物品要以外科手術(shù)方式嚴(yán)格消毒；=5\*GB3⑤室內(nèi)臺面要要保持潔凈，做完實(shí)驗(yàn)后，用75％酒精或千分之三新潔爾滅棉球擦拭超凈工作臺的臺內(nèi)、邊臺的臺面、倒置顯微鏡的載物臺等；=6\*GB3⑥所用物品要一次性準(zhǔn)備好；=7\*GB3⑦瓶口要用酒精火焰消毒；=8\*GB3⑧盡量減少出入。（2）實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備：=1\*GB3①肥皂洗手=2\*GB3②穿好隔離衣=3\*GB3③酒精棉球擦手【思考題】觀看演示填寫出無菌操作的要領(lǐng)。在無菌室工作時應(yīng)注意的事項(xiàng)是什么？實(shí)驗(yàn)過程中如何才能在頭腦中形成良好的無菌概念？

實(shí)驗(yàn)二：動物細(xì)胞前處理【實(shí)驗(yàn)原理】培養(yǎng)的動物細(xì)胞大都取自動物胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，將組織取出來后，先用胰蛋白酶等使組織分散成單個細(xì)胞，然后配制成一定濃度的細(xì)胞懸浮液，再將該懸浮液放入培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，這個過程稱為原代培養(yǎng)。細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長。隨著細(xì)胞的生長和增殖，培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞越來越多，需要定期地用胰蛋白酶使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，這稱為傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)三：動物細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制【實(shí)驗(yàn)原理】熟練掌握培養(yǎng)基(RPMIl640和DMEM)的配制，了解其他培養(yǎng)基的配制方法?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹拷M織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基一般是由合成培養(yǎng)基和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有商品出售，它是根據(jù)細(xì)胞生長的需要按一定配方制成的粉狀物質(zhì)。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)離子和其他輔助物質(zhì)。它的酸堿度和滲透壓與活體內(nèi)細(xì)胞外液相似。小牛血清含有一定的營養(yǎng)成分，更重要的是它含有細(xì)胞生長所必須的生長因子、激素、貼附因子等，這是合成培養(yǎng)基所無法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)的毒性。故一般體外培養(yǎng)細(xì)胞時要加入一定量的小牛血清(10％。20％)?！緦?shí)驗(yàn)器材】材料：3000mL錐形瓶，250mL或500mL培液瓶，翻帽塞，飯盒，pH試紙，孔徑0．22μm的微孔濾膜。藥品：鹽酸，無離子水，小牛血清，合成培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM)，青霉素，鏈霉素，NaHC03。儀器(請參看儀器圖庫)：濾泵(進(jìn)口)1套，濾器(進(jìn)口)1套，蒸餾器，高壓滅菌鍋，磁力攪拌器?！静僮鞑襟E】（相關(guān)鏈接培養(yǎng)基的制作方法）(一)準(zhǔn)備和安裝過濾器清洗好過濾器，干燥，放入一張孔徑0．22μm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20min進(jìn)行高壓滅菌處理。在超凈臺內(nèi)打開過濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用濾泵做正壓過濾，壓力數(shù)字為2。過濾后要檢查濾膜是否完好無損。(二)合成培養(yǎng)基的配制1．去離子水用蒸餾器進(jìn)行重新蒸餾(去除無機(jī)和有機(jī)雜質(zhì))，制3000mL三蒸水。三蒸水應(yīng)及時使用，如果放置一段時間，則使用前須高壓處理(15磅20min)。2．待水溫降至15—30℃C，加入合成培養(yǎng)基干粉，用磁力攪拌一定時間(2—3．配制RPMll640培養(yǎng)基時應(yīng)通入適量C02或加入6mol／L鹽酸調(diào)pH至6．0左右，這樣才能充分溶解。4．加入一定量NaHCO，調(diào)節(jié)pH至7．0左右。5．加水至最終體積。6．在超凈臺中對溶液進(jìn)行濾過除菌，分裝入250mL或500mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。7．瓶口封好，4℃冰箱貯存(RPMI1640培養(yǎng)基可以-20(三)小牛血清的處理市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補(bǔ)體(近來也有觀點(diǎn)認(rèn)為熱滅活處理是不必要的)。1．將血清加熱至56℃2．處理后的血清貯存于4℃3．小牛血清在使用前最好進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量(見八、新生牛血清的篩選)。(四)生長培養(yǎng)基的配制除無血清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需加入一定量的小牛血清和抗菌素。1．培養(yǎng)基分裝成小瓶(100～200mL)以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。2．按如下比例配制：基本培養(yǎng)基占80％－90％，小牛血清占10％－20％。按1％體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100U／mL和100μ／mL,?！咀⒁馐马?xiàng)】：1．培養(yǎng)細(xì)胞使用的瓶子和飯盒應(yīng)與提取RNA和培養(yǎng)細(xì)菌的瓶子和飯盒嚴(yán)格分開。因?yàn)橛糜谔幚硖崛NA的DEPC水(0．1％焦炭酸二乙酯)是一種致癌劑，并可能影響細(xì)胞生長；而培養(yǎng)過細(xì)菌的用品也不應(yīng)與細(xì)胞混用。2．過濾時壓力不要太大，以壓力數(shù)字2為宜，否則細(xì)菌易濾過達(dá)不到除菌效果，或使濾膜破裂。分裝時需根據(jù)使用量的多少分裝于大小合適的瓶子中(分裝量為使用3．5次用完為宜，并且每瓶只能裝2／3體積的液體，過多時瓶子易爆或膠塞自噴)。3。濾器用畢立即刷洗，過蒸餾水，晾干收藏。【操作步驟—詳細(xì)—細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與消毒】器材與試劑：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素.純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計、磁力攪拌器。具體步驟：一.

水的制備：細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水二.PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：1.溶解定容：將藥品（NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·H2O1.56g，KH2PO40.2g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。2.移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。三.胰蛋白酶溶液的配制與消毒：

胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37℃1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃四.青、鏈霉素溶液的配制于消毒1.

所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。2.具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。3.使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位＝1微克？五.RPMI1640的制備與消毒：1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml,使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。4.分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4℃5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃六．血清的滅火：細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃七.HEPES溶液：HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid）。對細(xì)胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。1mol/LHEPE緩沖液配制方法如下：準(zhǔn)確稱取HEPTS238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4℃注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20mmol/L。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。八.谷氨酰胺：合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L?？梢耘渲?00mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃九.肝素溶液的配制：含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為

℃。使用時，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。十.Ⅰ型膠原酶：0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃十一.明膠溶液：因?yàn)槊髂z難于過濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準(zhǔn)確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中，4℃其他培養(yǎng)用液的配制：20ug/ml內(nèi)皮生長因子，注意事項(xiàng)：1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值最終為7.2，可在配制時調(diào)PH至7.4。

實(shí)驗(yàn)四：細(xì)胞原代培養(yǎng)―乳鼠組織塊法原代培養(yǎng)【實(shí)驗(yàn)原理】直接從生物體內(nèi)獲取組織細(xì)胞進(jìn)行的首次培養(yǎng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步，是從事培養(yǎng)工作人員應(yīng)熟悉和掌握的最基本的技術(shù)。根據(jù)培養(yǎng)方法不同分為組織塊培養(yǎng)法和單層細(xì)胞培養(yǎng)法（消化培養(yǎng)法）。原代培養(yǎng)是獲取細(xì)胞的主要手段，但原代培養(yǎng)的組織由多種細(xì)胞成分組成，比較復(fù)雜，因而原代培養(yǎng)細(xì)胞部分生物學(xué)特征尚不穩(wěn)定，如要做較為嚴(yán)格的對比性實(shí)驗(yàn)研究，還需對細(xì)胞進(jìn)行純化。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆赵?xì)胞培養(yǎng)的一般方法和步驟及培養(yǎng)過程中的無菌操作技術(shù)，熟悉原代培養(yǎng)細(xì)胞的觀察方法?！緝x器、材料及試劑】1．儀器：培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、彎頭吸管、移液管、手術(shù)器械2．材料：新生1～3天的乳鼠3．試劑：DMEM培養(yǎng)基，Hank’s液，酒精。【操作步驟】組織塊直接培養(yǎng)法=1\*GB3①將新生大鼠引頸處死，置75%酒精泡2—3S（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再在超凈臺內(nèi)將新生小鼠解剖，取肝臟，置平皿中。=2\*GB3②用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。=3\*GB3③用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1mm2），再用Hank’s液洗三次。④將組織塊用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶內(nèi)，用彎頭吸管將組織塊在瓶壁上均勻擺置，每小塊間距0.5cm左右。25mL的培養(yǎng)瓶以20－30塊為宜。組織塊放好后，翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊，置37℃培養(yǎng)箱靜置3—5h，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37⑤組織塊培養(yǎng)3～5d后進(jìn)行換液?！咀⒁馐马?xiàng)】1．自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。2．在超凈臺中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。3．操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼后應(yīng)該待其冷卻才能夾取組織。4．操作動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機(jī)會。5．待組織塊略干燥能黏貼附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)基接觸，勿使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有貼壁，則細(xì)胞不易生長，即使生長也因沒有貼在瓶壁上面而無法收集到。附胰酶消化法=1\*GB3①同組織塊法前三步。=2\*GB3②視組織塊量加入5—10倍的0.25%胰酶液，37℃水浴中消化20—40min，每隔5min振蕩一次，使細(xì)胞分離。=3\*GB3③待組織變得疏松，顏色略為發(fā)白時，加入3—5ml培養(yǎng)液（含10%小牛血清）以終止胰蛋白酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。=4\*GB3④1000rpm，離心10min，棄上清液。消化后將細(xì)胞懸液通過100目孔徑不銹鋼網(wǎng)濾過，以除掉未充分消化的大組織。=5\*GB3⑤加入Hank’s液5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。=6\*GB3⑥加入培養(yǎng)液l—2ml（視細(xì)胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。=7\*GB3⑦將細(xì)胞調(diào)整到5×105個/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。上述消化分離的方法是最基本的方法，在該方法的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步分離不同細(xì)胞。細(xì)胞分離的方法各實(shí)驗(yàn)室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶，透明質(zhì)酶等）。【實(shí)驗(yàn)報告】記錄實(shí)驗(yàn)過程和細(xì)胞生長情況【思考題】1.細(xì)胞培養(yǎng)中如何防止污染？2.組織塊培養(yǎng)3～5d后進(jìn)行換液的目的是什么？3.比較組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法獲得原代培養(yǎng)物的效果和各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)五：培養(yǎng)細(xì)胞的觀察及保藏【實(shí)驗(yàn)原理】倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于－196℃在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)