微藻培養(yǎng)液濃縮采礦方法研究進(jìn)展

微藻培養(yǎng)液濃縮采礦方法研究進(jìn)展

網(wǎng)絡(luò)藝術(shù)。1家禽2非全日制和非全日制保障2.1藻體采收與油脂提取2.2Flocculationanddissolvedairflotation2.3Centrifugation2.4Filtration3Algallipidextractionmethods3.1Organicsolventextraction3.2Supercriticalfluidextraction3.3Subcriticalwaterextraction4Insitulipidmilking4.1Conceptofmilking4.2Applicationofmilking4.3Rulestochooseorganicsolventsformilkingestablishment4.4Mechanismoflipidextractionduringmilkingprocess5Problemsandprospects1引言由于石油資源日益枯竭和環(huán)境問(wèn)題的嚴(yán)峻緊迫,可再生能源的開(kāi)發(fā)利用成為關(guān)系國(guó)計(jì)民生的戰(zhàn)略性需求。生物柴油是生物能源的重要產(chǎn)品,但因原料不足使產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到嚴(yán)重制約。微藻具有光合效率高、零凈碳值、易培養(yǎng)、生長(zhǎng)周期短、油含量高等優(yōu)點(diǎn),是一種極具前景的生物柴油大宗原料,近年已引起各國(guó)政府和學(xué)者的高度關(guān)注。能源微藻是指油脂含量高于30%的藻類(lèi),例如:綠藻Chlorellasp.,Nannochloropsissp.,Botryococcussp.,Nannochlorissp.,Neochlorissp.,Dunaliellasp.,金藻Isochrysissp.和硅藻Chaetocerossp.,Cylindrothecasp.等,大部分綠藻缺氮培養(yǎng)時(shí)油脂含量有一定程度的提高,部分可達(dá)50%以上,硅藻則在培養(yǎng)基中硅含量較低時(shí)會(huì)促進(jìn)油脂合成。目前,通過(guò)能源微藻生產(chǎn)生物柴油的技術(shù)路線在實(shí)驗(yàn)室已打通,但存在的核心問(wèn)題是生產(chǎn)成本太高且產(chǎn)業(yè)化技術(shù)研究較少,如何從工程角度進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化技術(shù)改進(jìn)和深入研究微藻油脂合成機(jī)理,提高油脂產(chǎn)量是亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。近年來(lái)的研究熱點(diǎn)集中于藻種選育和培養(yǎng)條件優(yōu)化,利用代謝工程提高培養(yǎng)密度和油脂含量,設(shè)計(jì)微藻高密度培養(yǎng)的光生物反應(yīng)器等方面。盡管一定程度上提高了產(chǎn)量,但實(shí)際藻液生物質(zhì)含量仍然很低,通常密閉式反應(yīng)器培養(yǎng)獲得藻體生物量約4.0g·L-1,開(kāi)放式培養(yǎng)約0.14g·L-1。對(duì)于如此低生物質(zhì)含量藻液,藻體采收和油脂提取是制備微藻柴油技術(shù)路線的關(guān)鍵步驟,是決定最終能量輸出的重要影響因素。據(jù)測(cè)算,在微藻柴油的制備過(guò)程中,藻體采收、細(xì)胞干燥和油脂提取約占生物柴油生產(chǎn)成本的50%,導(dǎo)致整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程能源輸入與輸出的不平衡,限制了工業(yè)化應(yīng)用。因此,該階段技術(shù)改進(jìn)對(duì)降低生產(chǎn)成本有重要意義。本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀,從藻體采收和油脂提取技術(shù)兩方面展開(kāi)討論,并針對(duì)微藻生物柴油下游技術(shù)存在的問(wèn)題,提出今后可能的研發(fā)方向,旨在促進(jìn)我國(guó)微藻生物柴油的工業(yè)化生產(chǎn)。2藻液濃縮與藻體采收技術(shù)2.1重力沉降技術(shù)微藻細(xì)胞體積小,直徑約3—30μm,通過(guò)絮凝使藻體聚集成團(tuán)依賴(lài)重力作用沉降,是目前應(yīng)用最為廣泛的微藻采收技術(shù)之一。根據(jù)絮凝機(jī)制可分為陽(yáng)離子絮凝劑、pH值、電場(chǎng)介導(dǎo)等絮凝方法。2.1.1無(wú)機(jī)金屬鹽絮凝劑和殼聚糖微藻細(xì)胞外壁具有羥基、羧基、氨基、巰基和磷酸根等帶負(fù)電荷基團(tuán),具有膠粒性質(zhì),在水體中投入陽(yáng)離子型絮凝劑,絮凝劑水解生成帶正電荷的產(chǎn)物,能通過(guò)吸附電中和作用與帶負(fù)電荷的藻體形成聚集體沉降。陽(yáng)離子型絮凝劑分為Fe3+、Al3+、Mg2+、Ca2+等無(wú)機(jī)金屬鹽類(lèi),聚合硫酸鐵、聚合硫酸鋁等聚合金屬鹽類(lèi)和聚丙烯酰胺、殼聚糖等有機(jī)高分子聚合物三類(lèi)。針對(duì)不同藻種選擇絮凝劑的一般原則為:價(jià)格便宜,對(duì)藻體無(wú)致死作用,絮凝效率高及殘留對(duì)后處理無(wú)影響。FeCl3和Al2(SO4)3是最常用的無(wú)機(jī)金屬鹽絮凝劑,已應(yīng)用于Chlamydomonasreinhardtii,Botryococcusbraunii,Scenedesmus和Chlorella等,藻液的酸堿度對(duì)絮凝效果影響顯著,偏堿性環(huán)境(10<pH<11)有助于提高絮凝效率。聚合硫酸鐵是最常用的聚合鹽類(lèi)絮凝劑,與普通的金屬離子絮凝劑相比,這類(lèi)無(wú)機(jī)聚合鹽絮凝劑適用的pH值范圍較廣,絮凝效率也有明顯提高,藻體絮凝團(tuán)脫水后處理操作更簡(jiǎn)便。然而,因金屬離子殘留的影響,金屬鹽類(lèi)絮凝劑在食品、藥品級(jí)微藻領(lǐng)域的應(yīng)用受到極大限制。殼聚糖是一種可食用的直鏈高分子聚合物,因其無(wú)毒常用于食藥級(jí)藻體的絮凝采收。殼聚糖分子鏈上游離氨基在稀酸溶液中質(zhì)子化帶大量正電荷,能與帶負(fù)電荷的藻細(xì)胞接觸并中和其表面電荷,同時(shí),借助高分子鏈的吸附黏結(jié)和架橋作用產(chǎn)生藻體絮凝沉降。實(shí)際應(yīng)用中,藻細(xì)胞密度、離子強(qiáng)度、pH值,絮凝劑與藻液的混合程度等因素都會(huì)影響絮凝效率。通常殼聚糖對(duì)淡水藻的絮凝沉降作用優(yōu)于鹽水藻,當(dāng)體系中鹽度超過(guò)5g·L-1時(shí),絮凝效率會(huì)受到顯著抑制。同時(shí),殼聚糖對(duì)淡水藻的最適絮凝pH值要高于鹽水藻,如在pH=7.0左右,Spirulina,Oscillatoria和Chlorella等絮凝效率達(dá)90%,而對(duì)鹽水藻Synechocystis的最適絮凝pH值為5.0。此外,Chisti等研究發(fā)現(xiàn),低速攪拌有助于加快絮凝速度,而高速攪拌產(chǎn)生的剪切力會(huì)破壞藻體聚集成團(tuán)。2.1.2ph導(dǎo)電藻體絮凝某些藻種,因CO2的消耗或人為添加NaOH/Ca(OH)2所致藻液pH值上升也會(huì)引發(fā)藻體的自絮凝現(xiàn)象。其絮凝機(jī)制為:藻細(xì)胞表面帶有羥基、羧基等負(fù)電荷,當(dāng)pH調(diào)節(jié)為特定值時(shí),細(xì)胞表面的凈電荷為零(即細(xì)胞等電點(diǎn)),藻體發(fā)生脫穩(wěn)現(xiàn)象,從而產(chǎn)生自發(fā)絮凝行為。與絮凝劑方法相比,pH介導(dǎo)藻體絮凝操作簡(jiǎn)易,絮凝效率也相對(duì)較高。例如:對(duì)Thalassiosirapseudonana進(jìn)行多種絮凝方法的比較評(píng)價(jià),結(jié)果表明,僅用NaOH使藻液pH值調(diào)控至6.0—10.0即有藻體絮凝,當(dāng)培養(yǎng)液pH值達(dá)10.0時(shí),絮凝效率為97±2%,而且形成的藻團(tuán)體積大沉降快。針對(duì)能源藻Chlorella的研究表明,即使培養(yǎng)液中細(xì)胞密度較低(初始生物量為0.18g·L-1),堿化后絮凝效率仍有90%以上,而且絮凝后的藻體仍能保持較高活性,調(diào)節(jié)pH值至中性可使藻團(tuán)快速去絮凝呈單細(xì)胞懸浮液。然而對(duì)一些特定藻種,pH介導(dǎo)絮凝采收藻體的方法也存在弊端。如二十碳五烯酸(eicosapntemacniocacid,EPA)高產(chǎn)藻種Skeletomacostatum,pH=10.2時(shí)藻體絮凝率達(dá)80%,但回收藻體中相當(dāng)一部分細(xì)胞發(fā)生解體及胞內(nèi)成分外泄,嚴(yán)重影響后續(xù)EPA提取工藝。2.1.3含氟低表面活性劑的氣浮除離子型絮凝劑和堿化絮凝等化學(xué)方法外,利用外加電場(chǎng)的物理絮凝法也是常用的藻體采收技術(shù)[25—27]。在水溶液介質(zhì)中,藻細(xì)胞呈電負(fù)性,易向外加電場(chǎng)中的正極移動(dòng),一旦藻細(xì)胞到達(dá)正極即發(fā)生電中和作用,繼而產(chǎn)生絮凝行為。同時(shí),藻液中的水在電極附近發(fā)生解離產(chǎn)生O2(正極)和H2(負(fù)極),大量氣泡帶動(dòng)絮凝藻團(tuán)浮于水體表層,便于采收,裝置示意圖見(jiàn)圖1。電場(chǎng)介導(dǎo)藻體絮凝兼具絮凝和氣浮過(guò)程,無(wú)需在培養(yǎng)液中添加化學(xué)絮凝劑,特別適用于含藥用或食用級(jí)活性物質(zhì)藻體的采收。該方法對(duì)綠藻(Scenedesmusacutus,Chlorellavulgaris,Closteriumsp.,Cryptomonassp.,Staurastrumsp.,Botryococcusbraunii),藍(lán)綠藻(Coelosphaeriumsp.,Aphanizomenonsp.)和硅藻(Asterionellasp.,Cvclotellasp.,Melosirasp.)等都有較高的絮凝效率,且電勢(shì)差、電極表面積和正負(fù)電極間距等因素對(duì)總能耗有顯著影響。2.1.4超聲波輔助萃取微藻近年來(lái),除上述藻體絮凝處理方法外,超聲波、生物絮凝劑或微藻與微生物共培養(yǎng)形成絮凝物沉降的方法也屢有報(bào)道。細(xì)菌Paenibacillussp.AM49是常用的生物絮凝劑,對(duì)Botryococcusbraunii,Selenastrumcapricornutum,Chlorellavulgaris和Scenedesmussp.等綠藻絮凝效果良好,藻體采收率為91%—95%,然而對(duì)藍(lán)藻Anabaenaflosaquae,Microcystisaeruginosa等藻體采收率明顯降低,僅為38%—49%。高頻超聲波能促使Microcystisaeruginosa絮凝沉降,但長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)使細(xì)胞破裂失活,同時(shí)釋放藻毒素至胞外,影響水體質(zhì)量及培養(yǎng)液回用。由于細(xì)菌為異養(yǎng)生長(zhǎng)方式,需在培養(yǎng)液中另加入有機(jī)碳源促進(jìn)生長(zhǎng),增加了培養(yǎng)成本的投入。針對(duì)這一問(wèn)題,近期報(bào)道的利用不同絮凝能力微藻共培養(yǎng)進(jìn)行藻體采收方法為工業(yè)規(guī)模微藻收集提供了新思路。Salim等選用Ankistrodesmusfalcatus、Scenedesmusobliquus、Tnkistrodesmussuecica等能夠發(fā)生自絮凝的藻種與非自絮凝藻同時(shí)自養(yǎng)培養(yǎng),其中一種藻種發(fā)生自絮凝時(shí)能通過(guò)架橋作用和電中和機(jī)制使另一藻種發(fā)生共絮凝沉降,提高藻體收率。另外,關(guān)于超聲波絮凝機(jī)制目前還不明確,有人認(rèn)為超聲波通過(guò)破壞藻細(xì)胞中的微囊泡來(lái)增加藻體密度絮凝沉降,另有說(shuō)法:當(dāng)超聲波作用于藻細(xì)胞時(shí)(圖2A),細(xì)胞受力移動(dòng)至聲波壓力節(jié)點(diǎn)位層(圖2B),隨后在節(jié)點(diǎn)處絮凝成團(tuán)(圖2C),停止超聲后藻團(tuán)因重力作用沉降。2.2溶解狀態(tài)下微藻絮凝團(tuán)分離溶解氣浮法(dissolvedairflotation,DAF)最早報(bào)道于廢水處理過(guò)程中活性污泥的回收,目前也可用于水體除藻和人工養(yǎng)殖微藻的采收,為提高收率多與絮凝技術(shù)結(jié)合。DAF操作流程:在一定壓力下通入空氣,并使之在水中呈飽和溶解狀態(tài),氣泡黏附于藻團(tuán)降低絮凝團(tuán)整體密度,然后壓力驟降導(dǎo)致氣體溶解度降低,水中溶解的空氣從水體析出,形成直徑0.01—0.1mm的微小氣泡,密集度大且粒度均勻的氣泡上浮,帶動(dòng)疏松的微藻絮凝團(tuán)浮于水面便于收集。與傳統(tǒng)的絮凝沉降法相比,絮凝氣浮法能在較短時(shí)間內(nèi)取得更高的藻體收率,而且絮凝劑的消耗量也顯著降低。例如DAF法采收水體中藍(lán)藻Microcystisaeruginosa,絮凝劑Al2O3添加量(DAF3mg·L-1vs沉降法5mg·L-1),絮凝時(shí)間(DAF8min70s-1vs沉降法15min24s-1)和藻體收率(DAF93%—98%vs沉降法69%—94%)都明顯優(yōu)于絮凝沉降法。影響DAF藻體采收效率的因素包括氣泡大小、氣液混合效率以及適于規(guī)模操作的工程設(shè)備改進(jìn)等。2.3能耗大的情況離心法是一種快速的細(xì)胞采收方法,然而若要對(duì)規(guī)?；B(yǎng)殖微藻進(jìn)行藻/水高通量分離,則前期離心設(shè)備的購(gòu)買(mǎi)安裝需較大資金投入,同時(shí)操作過(guò)程能耗也較大。離心法的收率決定于離心力大小(轉(zhuǎn)速)、藻細(xì)胞沉降特性(細(xì)胞大小)、藻液在離心機(jī)內(nèi)停留時(shí)間及沉降距離等因素。Chisti等詳細(xì)闡述了針對(duì)特定藻種選擇和使用合適離心機(jī)的原則。Heasman等比較了離心法對(duì)9株藻的采收率及細(xì)胞活性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),離心力為13000g時(shí)95%藻體可沉降收集,但是離心力降低10倍(1300g)收率僅為40%,離心后的細(xì)胞活性則與藻種密切相關(guān)。2.4藻體按功能分區(qū)布設(shè)微藻生物柴油對(duì)于部分藻種,簡(jiǎn)單過(guò)濾也能有效采收藻體。對(duì)Spirulinaplatensis(細(xì)胞長(zhǎng)400—600μm),Coelastrumsp.(細(xì)胞群直徑50—100μm)等個(gè)體較大的藻種,沙濾,纖維素濾器和硅藻土過(guò)濾等方法都具有良好的脫水效果,加壓操作有利于提高收率,例如,對(duì)Coelastrumproboscideum的壓濾濃縮倍數(shù)為245倍。對(duì)于Isochrysis,Dunaliella和Chlorella等細(xì)胞直徑小于10μm的微藻,微濾和超濾可以有效截留藻細(xì)胞,但在操作過(guò)程中需注意以下幾點(diǎn):(1)濾膜選擇膜材料可選平板或中空纖維陶瓷膜、PVC膜和PAN膜等,截留分子量范圍為40—60kDa,剪切力敏感藻種易用微濾法。(2)操作條件加壓或抽真空能提高膜通量,膜過(guò)濾法還可以進(jìn)行藻液的連續(xù)濃縮。(3)膜污染控制過(guò)濾時(shí),藻體易堵塞膜孔降低通量,同時(shí)大量有機(jī)質(zhì)殘留導(dǎo)致膜污染,空氣反沖使濾餅剝離膜表面以及NaClO溶液周期性清洗濾膜是控制膜污染的常用方法。關(guān)于各種微藻采收方法的應(yīng)用及效率比較見(jiàn)表1。鑒于不同方法原理的區(qū)別,藻體采收效率取決于藻體大小、細(xì)胞表面電荷分布等屬性。針對(duì)不同藻種特性和用途應(yīng)選擇適宜的采收方法,例如用于食藥加工的微藻則適于離心、過(guò)濾等機(jī)械采收方法,而基于化學(xué)、生物絮凝等方法則可用于水體處理過(guò)程中藍(lán)藻的去除或非食藥用途藻體采收。目前,能源微藻的大規(guī)模培養(yǎng)方式主要是開(kāi)放池和密閉光生物反應(yīng)器兩種。開(kāi)放池藻體生長(zhǎng)密度較低,而且存在不同程度的微生物和固體顆粒污染,而密閉式反應(yīng)器基本為無(wú)菌培養(yǎng),微藻濃度可比開(kāi)放式培養(yǎng)提高10倍以上。針對(duì)工業(yè)規(guī)模能源微藻采收通常結(jié)合其中兩種或兩種以上的方法處理,例如:先在培養(yǎng)池或反應(yīng)器中加入化學(xué)或生物絮凝劑使藻體成團(tuán),再以沉降或氣浮方式收集藻團(tuán)達(dá)到濃縮藻液的目的,后期則利用離心或過(guò)濾等物理方法進(jìn)一步使藻水分離,對(duì)得到的藻泥進(jìn)行晾曬或冷凍干燥處理使之成為藻粉?，F(xiàn)有國(guó)內(nèi)微藻養(yǎng)殖廠則多采用離心或過(guò)濾法濃縮藻液,再經(jīng)噴霧干燥法得到藻粉。為提高微藻生物柴油的經(jīng)濟(jì)性,藻體采收后剩余大量培養(yǎng)液的回用是降低成本的積極措施之一,然而基于pH值、化學(xué)和細(xì)菌等絮凝劑對(duì)微藻生長(zhǎng)影響的考慮,離心、過(guò)濾以及自絮凝微藻共培養(yǎng)的方法更適于能源微藻的采收。3微藻油脂提取技術(shù)除藻體采收外,細(xì)胞內(nèi)油脂組分的提取也是微藻生物柴油制備工藝的重要環(huán)節(jié)。微藻油脂提取技術(shù)包括有機(jī)溶劑萃取法、超臨界流體萃取和熱裂解等,這些方法要求藻體為干燥粉末,而藻液中干物質(zhì)含量通常低于1%,濃縮干燥的預(yù)處理不僅延長(zhǎng)生物柴油生產(chǎn)周期,還影響油脂提取效率。為了避開(kāi)濃縮干燥等步驟,亞臨界水提取、直接轉(zhuǎn)酯、原位萃取及促使微藻油脂分泌至胞外的新方法應(yīng)運(yùn)而生,但這些技術(shù)還僅限于實(shí)驗(yàn)室水平,未達(dá)到工業(yè)化要求。3.1有機(jī)溶劑的萃取方法3.1.1雙溶劑體系的選擇雙溶劑體系萃取(mixingco-solventextraction)是指由一種極性溶劑與一種非極性溶劑組成單相體系提取藻體油脂,目前,Bligh和Dyer于1959年提出的甲醇/氯仿體系仍是最常用的微藻油脂提取方法?；凇跋嗨葡嗳堋痹?藻體與甲醇/氯仿混合溶劑充分接觸,極性溶劑甲醇與細(xì)胞膜的極性脂結(jié)合,從而破壞脂質(zhì)與蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和靜電作用,使非極性溶劑氯仿進(jìn)入細(xì)胞并溶解胞內(nèi)疏水的中性脂成分,充分萃取后在體系中加入水,甲醇即溶于水相而與含油脂的氯仿相分層,氯仿?lián)]發(fā)后得到粗脂提取物。然而因氯仿有神經(jīng)致毒作用,一些低毒雙溶劑體系也嘗試用于油脂提取,例如正己烷/異丙醇,DMSO/石油醚,正己烷/乙醇等。應(yīng)用于溶劑萃取法的相關(guān)設(shè)備主要是基于索氏提取原理設(shè)計(jì)的,分為半自動(dòng)或全自動(dòng)兩種類(lèi)型,如瑞士BUCHI公司、德國(guó)格哈特(Gerhardt)公司生產(chǎn)的脂肪提取器等。為提高油脂提取率,選擇合適的溶劑體系及溶劑添加順序至關(guān)重要。在實(shí)際應(yīng)用中,雙溶劑體系的選取原則包括:(1)極性溶劑能有效破壞細(xì)胞膜脂和膜蛋白間結(jié)合力,使細(xì)胞膜疏松多孔;(2)非極性溶劑的親疏水性盡可能與細(xì)胞內(nèi)油脂成分的性質(zhì)接近;(3)可結(jié)合高溫高壓或機(jī)械破壞細(xì)胞膜的方法提高油脂提取率。萃取過(guò)程中溶劑添加順序則需按極性遞增原則,如對(duì)Nannochloropsis藻粉依次加入氯仿、甲醇、水,油脂提取率為21.0%,而按相反順序添加溶劑(水、甲醇、氯仿),提取率降低為18.5%(見(jiàn)表2)。其原因可能是,體系中的水先在油脂表面形成保護(hù)層,阻礙油脂與氯仿直接接觸,增加其溶解在氯仿等弱極性溶劑中的難度。因此,藻體含較多水分時(shí),攪拌、超聲波或加大溶劑量都不會(huì)顯著提高油脂萃取效率。W-M-C:water-methanol-chloroform,a:Thehighestextractionyieldwasdefinedas100%efficiencyforcomparison.3.1.2ase法萃取微藻油脂1996年,Richter等提出快速溶劑提取法(acceleratedsolventextraction,ASE),這是一種在較高溫度(50—200℃)和較大壓力(10.3—20.6MPa)條件下用溶劑萃取固體或半固體樣品的處理方法。該方法用于萃取微藻油脂的原理是:高溫高壓有助于增加傳質(zhì)速率使溶劑快速滲入藻細(xì)胞,同時(shí)降低溶劑介電常數(shù)使其極性接近油脂,從而提高溶劑的萃取效率。常用溶劑體系有甲醇/氯仿,異丙醇/正己烷等,流程示意圖見(jiàn)圖3。與雙溶劑萃取法相比,ASE法具有作用時(shí)間短(5—10min),溶劑消耗量少,油脂提取率高的優(yōu)點(diǎn)。例如,傳統(tǒng)的Folch方法(氯仿/甲醇,2∶1(v/v))對(duì)綠藻Rhizocloniumhieroglyphicum的油脂提取率為44%—55%,而用等量溶劑在壓力10.3MPa,120℃時(shí)僅提取5min即可達(dá)到85%—95%的油脂提取率。常用的快速溶劑提取裝置有美國(guó)DionexThermo公司的ASE150/350、瑞士BUCHI公司的E-916等型號(hào)儀器。system3.1.3脂肪酸甲酯的合成原位轉(zhuǎn)酯化(insitutransesterification)是指冷凍干燥的藻粉在強(qiáng)酸催化劑(如HCl,H2SO4)作用下能與醇(如甲醇)發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成脂肪酸甲酯。原位酯化法省去脂肪酸提取步驟,有效簡(jiǎn)化了生物柴油的生產(chǎn)工藝。該方法最早報(bào)道于動(dòng)物脂肪組織的直接酯化,后證實(shí)可廣泛應(yīng)用于棉籽、葵花籽、真菌和微藻等高含油量生物質(zhì)中脂肪酸的甲酯化。對(duì)微藻原位酯化的研究表明,反應(yīng)物在密閉容器中加熱至100℃僅需1h即可反應(yīng)完全,在體系中加入正己烷可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物脂肪酸甲酯的一步純化;若將底物醇與乙醚、甲苯等弱極性溶劑混合,則能通過(guò)改變反應(yīng)介質(zhì)極性而提高產(chǎn)率。與其他方法不同的是,反應(yīng)過(guò)程中細(xì)胞膜極性脂成分也發(fā)生酯化導(dǎo)致脂肪酸甲酯收率明顯提高,甚至對(duì)幾乎不含中性脂的藍(lán)藻(Synechocystissp.PCC6803,Synechococcuselongatus),脂肪酸甲酯產(chǎn)率也有7.1%。然而樣品含水量對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響顯著,藻水比為1∶1時(shí),酯化產(chǎn)率僅為干燥樣品的50%。3.2微藻油脂的提取超臨界流體萃取(supercriticalfluidextraction)是一種新興的提取技術(shù),它是指超出臨界溫度和壓力時(shí),流體介于氣態(tài)和液態(tài)之間,同時(shí)具有氣體的擴(kuò)散傳質(zhì)性能和液體的溶解性能,對(duì)藻體油脂的提取效率遠(yuǎn)高于普通的有機(jī)溶劑。CO2由于臨界條件溫和(壓力7.4MPa,溫度31.1℃)、無(wú)毒、化學(xué)惰性等優(yōu)勢(shì),使用最為廣泛。此外,甲醇、乙醇、水、二氧化氮、六氟化硫等使用也有報(bào)道。超臨界CO2萃取(supercriticalcarbondioxideextraction,SCCO2)微藻油脂的作用條件為40—50℃,24.1—37.9MPa,提取后油脂溶解在超臨界液態(tài)CO2中,回收時(shí)只需控制溫度和壓力使CO2恢復(fù)氣態(tài)即可分離油脂,流程示意圖見(jiàn)圖4。鄭承熙等發(fā)明的連續(xù)萃取裝置即先通過(guò)壓力對(duì)藻體破壁,所得藻泥再(SCCO2)unit經(jīng)超臨界CO2對(duì)油脂部分進(jìn)行連續(xù)萃取處理。超臨界萃取是環(huán)境友好的綠色提取技術(shù),但是因涉及到溫度和壓力控制,使得處理工藝能耗高,經(jīng)濟(jì)性較差,不適于大宗化學(xué)品的提取。利用超臨界流體萃取微藻油脂過(guò)程對(duì)溫度和壓力有嚴(yán)格的控制,所用設(shè)備在工業(yè)規(guī)模的中藥有效成分和生物活性物質(zhì)提取方面已有應(yīng)用,能供應(yīng)全套設(shè)備的公司有美國(guó)的ASI公司,ISCO公司以及SFT公司等。3.3原位油脂萃取法亞臨界水萃取(subcriticalwaterextraction,SWE)是指水在略低于臨界溫度時(shí)其極性降低,因此具有類(lèi)似有機(jī)溶劑的性質(zhì),對(duì)油脂的溶解性也大大提高;同時(shí),利用高壓使水維持在液態(tài),高溫促使水快速進(jìn)入細(xì)胞,使胞內(nèi)脂質(zhì)萃取至水相;當(dāng)體系冷卻至室溫時(shí),水的極性升高,溶解在水相的油脂與水迅速分層便于收集,流程示意圖見(jiàn)圖5。此外,亞臨界乙醇也可用來(lái)萃取色素,如萃取Haematococcuspluvialis和Dunaliellasalina中的胡蘿卜素。該方法的優(yōu)勢(shì)在于可以對(duì)藻液直接處理,在體系中無(wú)需加入有機(jī)溶劑,但是因溫度壓力等高能耗步驟的存在,此法工業(yè)應(yīng)用也有所限制。unit(SR,solventreservoir;PV,purgevalve;RV,pressurereliefvalve;EC,extractioncell;SV,staticvalve;CV,collectorvial;WV,wastevial)4原位油脂萃取法由于微藻培養(yǎng)所得生物量濃度不高,因此對(duì)藻體依次進(jìn)行采收、干燥及油脂提取處理總能耗較大,是微藻柴油實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的主要挑戰(zhàn)。針對(duì)該問(wèn)題,本課題組提出微藻油脂原位萃取的新方法,從系統(tǒng)工程的角度出發(fā),使微藻采收與油脂提取進(jìn)行過(guò)程集成,并對(duì)建立此方法時(shí)有機(jī)溶劑的選擇原則和產(chǎn)物萃取機(jī)制等問(wèn)題做了深入研究。4.1微藻油脂原位萃取原理原位萃取(milking)是指建立生物相容性有機(jī)溶劑與藻液共混的兩相體系,使目標(biāo)產(chǎn)物不斷萃取至溶劑相,同時(shí)藻細(xì)胞仍不斷合成產(chǎn)物的模式,使微藻采收與產(chǎn)物提取過(guò)程集成,實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物在線提取和提高產(chǎn)量的雙重目標(biāo),原理示意圖見(jiàn)圖6。與傳統(tǒng)方法相比,微藻油脂原位萃取具以下優(yōu)勢(shì):(1)常溫常壓操作;(2)培養(yǎng)與提取同步進(jìn)行,無(wú)需藻體干燥;(3)解除產(chǎn)物抑制,提高油脂產(chǎn)量。biphasicsystem4.2有機(jī)溶劑的應(yīng)用目前,原位萃取的方法已在色素、烴類(lèi)、DHA和紫杉醇等藻或高等植物細(xì)胞產(chǎn)品提取方面有所報(bào)道。Hejazi等利用兩相培養(yǎng)體系培養(yǎng)Dunaliellasalina生產(chǎn)β-胡蘿卜素,發(fā)現(xiàn)logP>6的有機(jī)溶劑生物相容性較高,且兩相反應(yīng)體系中β-胡蘿卜素總產(chǎn)量比單水相培養(yǎng)也有所提高。韓國(guó)的An等用正辛烷與水的兩相體系培養(yǎng)及提取Botryococcusbraunii細(xì)胞中烴類(lèi)成分,烴的提取率達(dá)57%。Xu等用油酸與水的兩相體系培養(yǎng)紫杉細(xì)胞和提取其代謝產(chǎn)物紫杉醇,并研究了有機(jī)溶劑對(duì)紫杉細(xì)胞膜通透性的影響。兩相反應(yīng)器培養(yǎng)Haematococcuspluvialis生產(chǎn)蝦青素的實(shí)驗(yàn)也獲得了成功。此外,有機(jī)溶劑與水組成的兩相培養(yǎng)體系在神經(jīng)毒素、DHA等高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)方面也有所研究。4.3生物原位萃取能力和萃取效率與藥物關(guān)系選擇適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑是建立原位萃取體系的首要任務(wù),一般來(lái)說(shuō),需遵循以下原則。(1)生物相容性在原位萃取過(guò)程中,為保證藻體生長(zhǎng)和持續(xù)合成產(chǎn)物,所用有機(jī)溶劑首先需滿(mǎn)足對(duì)細(xì)胞的高生物相容性。溶劑對(duì)藻體的生物相容性由溶劑體積比、疏水性(logP)、分子量等物理特性決定。通常在建立的兩相體系中,溶劑相體積不超過(guò)總體積的15%。相比而言,疏水性強(qiáng)、分子量大的有機(jī)溶劑一般具有較高的生物相容性。對(duì)不同藻種的研究表明,溶劑疏水性(logP)與分子量對(duì)藻細(xì)胞活性的影響呈“S”形關(guān)系,拐點(diǎn)位置logP范圍為5.5—6.0,疏水性高于拐點(diǎn)logP的溶劑具有較好的生物相容性,而低于該拐點(diǎn)logP的溶劑則對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有致死作用,如圖7所示。隨藻種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不同,拐點(diǎn)logP也略有差別,例如,無(wú)細(xì)胞壁的DunaliellasalinalogP>6的溶劑生物相容性較高,具細(xì)胞壁的Nannochloropsissp.和Botryococcusbraunii,拐點(diǎn)logP為5.5。(2)產(chǎn)物萃取效率有機(jī)溶劑對(duì)產(chǎn)物的親合性和萃取率是影響原位萃取過(guò)程經(jīng)濟(jì)性的重要因素。對(duì)于胡蘿卜素、蝦青素等產(chǎn)品,正辛醇等偏親水性溶劑有較高的萃取率,但綜合考慮生物相容性等影響,通常多以十二烷、十四烷等強(qiáng)疏水性溶劑建立兩相原位萃取體系。(3)溶劑回收率原位萃取過(guò)程中,有機(jī)溶劑循環(huán)萃取能極大程度地提高產(chǎn)物收率,而溶劑總消耗量主要受其揮發(fā)性的影響,因此選擇原位萃取的有機(jī)溶劑時(shí)要充分考慮溶劑回收率。10%(v/v)differentorganicsolventsundercontinuousilluminationat60μmolphotonsm-2·s-1and25℃for96h4.4原位萃取法對(duì)十四烷-水兩相體系中Botryococcusbraunii油脂原位萃取研究表明,十四烷對(duì)藻體油脂萃取過(guò)程分為如下4個(gè)步驟(圖8):(1)油脂合成及包裝。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成甘油三酯,并與蛋白質(zhì)結(jié)合包裝成脂滴以存貯能量。(2)油脂以囊泡介導(dǎo)跨膜運(yùn)輸。在靠近胞內(nèi)脂滴聚集的位置,細(xì)胞膜發(fā)生褶皺并向外隆起,形成數(shù)個(gè)清晰可見(jiàn)的囊泡,胞內(nèi)油脂向外分泌是通過(guò)囊泡介導(dǎo)的胞吐作用實(shí)現(xiàn)的。(3)油脂分泌至質(zhì)壁間forBotryococcusbrauniiinatetradecane-aqueoussystem隙。脂滴顆粒通過(guò)細(xì)胞胞吐作用進(jìn)入原生質(zhì)體與細(xì)胞壁間的空腔內(nèi)。(4)油脂擴(kuò)散出細(xì)胞壁進(jìn)入有機(jī)相。十四烷-水兩相培養(yǎng)體系中,藻細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得松散多孔,使質(zhì)壁間隙的油脂容易穿過(guò)細(xì)胞壁擴(kuò)散進(jìn)入有機(jī)相。本課題組以Botryococcusbraunii為出發(fā)藻種,篩選出其生物相容性良好的有機(jī)溶劑十四烷進(jìn)行原位油脂萃取實(shí)驗(yàn),并引入有機(jī)材料的中空纖維膜作為介質(zhì),以提高溶劑在藻液中的分散效率,有效增加藻體與有機(jī)溶劑的接觸面積,保持藻液與溶劑體積比為10∶1