分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件

分子病理學(xué)方法分子病理學(xué)方法1分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件21.探討疾病發(fā)生分子機(jī)制的基本思路探討基因結(jié)構(gòu)的改變與疾病發(fā)生的關(guān)系探討基因表達(dá)的改變與疾病發(fā)生的關(guān)系蛋白質(zhì)水平核酸水平尋找疾病相關(guān)基因1.探討疾病發(fā)生分子機(jī)制的基本思路探討基因結(jié)構(gòu)的改變與疾病發(fā)32.分子克隆及分子探針制作技術(shù)限制性?xún)?nèi)切酶質(zhì)粒載體分子克隆的步驟分子探針的制作常用標(biāo)記物及顯示系統(tǒng)2.分子克隆及分子探針制作技術(shù)限制性?xún)?nèi)切酶4核酸酶核酸外切酶核酸內(nèi)切酶核酸酶核酸外切酶5限制性?xún)?nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶是核酸酶的一種，核酸酶通常是指能夠水解磷酸二脂鍵裂解DNA或RNA的酶。有些核酸酶對(duì)DNA的裂解是非特異的，也就是說(shuō)它們?cè)诤怂岱肿觾?nèi)的切割是隨機(jī)的。而另一些酶卻能識(shí)別DNA分子的某些特定序列對(duì)DNA分子有選擇的切割，這種酶就稱(chēng)為限制性?xún)?nèi)切核酸酶（限制酶）。限制性?xún)?nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶是核酸酶的一種，核酸酶通常是指能夠水6回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)：雙鏈DNA中含有的結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列。例如：5'GGTACC3'3'CCATGG5'回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)：雙鏈DNA中含有的結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列7分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件8限制性?xún)?nèi)切酶（EcoRⅠ）GAATTCCTTAAG5’NNNNGAATTCNNNN3’3’NNNNCTTAAGNNNN5’

5’NNNNGpAATTCNNNN3’3’NNNNCTTAApGNNNN5’限制性?xún)?nèi)切酶（EcoRⅠ）GAATTC9限制性?xún)?nèi)切酶（HaeⅢ）GGCCCCGG5’NNNNNGGCCNNNNN3’3’NNNNNCCGGNNNNN5’5’NNNNNGGpCCNNNNN3’3’NNNNNCCpGGNNNNN5’限制性?xún)?nèi)切酶（HaeⅢ）GGCC10

5`GAATTC3`RestrictionEnzyme:EcoRI3`CTTAAG5`Cleavage5`GAATTC3`3`CTTAAG5`StickyendsDNALigases3`TTAAP5`OH+3`TTAAP5`OH3`CGP5`OH3`TACGP5`OHACBComplementaryendsbase-pair5`AATT3`3`TTAA5`OHPPOH+UnpairedBandC5`AATT3`3`TTAA5`DNAligasesMechanism5`GAATTC11分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件12分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件13分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件14分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件15分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件16質(zhì)粒載體質(zhì)粒的基本特性復(fù)制能力選擇標(biāo)記常用的質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體發(fā)展的三個(gè)階段常用的質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒的基本特性17PlasmidsinE.colicellFromalysedE.colicell:

TheE.coligenomeconsistsofasinglechromosomewhichisadouble-strandedcircularDNAmoleculewith4,639,221basepairs.E.colialsocontainsmallercircularDNAmoleculesthatarefreeinthecytosol(plamids);seewhitearrowsinfigure.PlasmidsinE.colicellFroma18分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件19分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件20分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件21分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件22分子克隆的步驟分子克隆的步驟23分子克隆的基本步驟歸納起來(lái)為5個(gè)字：分、切、接、轉(zhuǎn)、篩。分：克隆目的基因。切：限制內(nèi)切酶切開(kāi)質(zhì)粒和目的基因。接:將目的基因連接到載體中，形成重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌中。

篩：篩選重組成功的轉(zhuǎn)化子。分子克隆的基本步驟歸納起來(lái)為5個(gè)字：分、切、接、轉(zhuǎn)、篩。24分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件25分子克隆流程圖分子克隆流程圖26分子探針的制作分子探針的制作27缺口平移法Nicktranslation缺口平移法Nicktranslation28隨機(jī)引物法

RandomprimedDNAlabeling隨機(jī)引物法

RandomprimedDNAlabel29體外轉(zhuǎn)錄法Invitrotranscription體外轉(zhuǎn)錄法Invitrotranscription30末端標(biāo)記法Endlabeling末端標(biāo)記法Endlabeling31常用標(biāo)記物及顯示系統(tǒng)同位素生物素Biotin地高辛Digoxigenin常用標(biāo)記物及顯示系統(tǒng)同位素32同位素

32P 半衰期14.3天

35S 半衰期87.4天

125I

半衰期59.7天

3H 半衰期12.35年同位素32P 半衰期14.3天33生物素

生物素是最早用來(lái)替代同位素的非放射性標(biāo)記物，其分子量?。?44Da），可與親合素（avidin）特異結(jié)合。生物素34地高辛

異羥基洋地黃毒苷配基（Digoxigenin）又稱(chēng)地高辛，是近幾年被廣泛采用的非放射性標(biāo)記物之一。DIG是從植物洋地黃中提取的半抗原類(lèi)固醇物質(zhì)，通過(guò)連接臂（Linker-arm）與dUTP或UTP連接，形成Dig-dUTP或Dig-UTP復(fù)合物，利用各種標(biāo)記技術(shù)可將Dig-dUTP引入新合成的探針DNA鏈中。地高辛 異羥基洋地黃毒苷配基（Digoxigenin）35分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件363.分子雜交技術(shù)分子雜交的基本策略常用分子雜交技術(shù)3.分子雜交技術(shù)分子雜交的基本策略37分子雜交的基本策略寬松雜交嚴(yán)格漂洗分子雜交的基本策略38Tm值的計(jì)算Tm(℃)=16.6logM+0.41(%G+C)+81.5–

820/L–1.2(100-h)M—themonovalentcationconcentration%G+C—thebasecompositionL—theduplexlength(bp)h—thepercentinterstrandhomology(↓0.7℃peronepercentFormamide)

Tm值的計(jì)算Tm(℃)=16.6logM+0.39最佳雜交溫度的設(shè)定Th=Tm–25℃ （forDNAprobe）Th=Tm–15℃ （forRNAprobe）最佳雜交溫度的設(shè)定Th=Tm–25℃ （forDN40常用分子雜交技術(shù)Southern雜交(Southernblothybridization)Northern雜交

(Northernblothybridization)斑點(diǎn)雜交

(Dotblothybridization)原位雜交(Insituhybridization)常用分子雜交技術(shù)Southern雜交(Southernb41SouthernblothybridizationSouthernblothybridization42SouthernblothybridizationSouthernblothybridization43NorthernblothybridizationNorthernblothybridization44NorthernblothybridizationNorthernblothybridization45DotblothybridizationDotblothybridization46DotblothybridizationDotblothybridization47InsituhybridizationInsituhybridization48

端粒原位雜交

端粒原位雜交49InsituhybridizationInsituhybridization50InsituhybridizationInsituhybridization51InsituhybridizationInsituhybridization52InsituhybridizationInsituhybridization53分子病理學(xué)方法優(yōu)質(zhì)課件54熒光原位雜交熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)，以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法。熒光原位雜交熒光原位雜交（fluorescenceins55細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)原理：通過(guò)熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交觀(guān)察：熒光顯微鏡原位觀(guān)察（細(xì)胞、組織）細(xì)胞核彩色探針信號(hào)目的：獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體(或染色體片段)或多種基因狀態(tài)的信息。

Fluorescenceinsituhybridization（FISH）細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)Fluorescenceinsituh56用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線(xiàn)性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位熒光標(biāo)記探針探針變性樣本DNA變性雜交原理用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中57FISH技術(shù)的特點(diǎn)操作簡(jiǎn)便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，可與多種技術(shù)結(jié)合，可成功地幫助細(xì)胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析方法敏感，能迅速得到結(jié)果，24小時(shí)就可以完成檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源豐富，間期細(xì)胞，分裂中期細(xì)胞、分化或未分化細(xì)胞及死亡或存活的細(xì)胞皆可以被檢測(cè)FISH技術(shù)的特點(diǎn)操作簡(jiǎn)便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，可與多種技術(shù)結(jié)合58centromeretelomeresubtelomerelocusspecificwholechromosomepaintCSP探針：染色體著絲粒探針GLP探針：位點(diǎn)特異性探針WPP探針：全染色體或染色體區(qū)域特異性探針FISH探針的種類(lèi)centromeretelomeresubtelomer59操作流程簡(jiǎn)圖制片預(yù)處理FISH結(jié)果分析破壞細(xì)胞膜利于探針雜交。蛋白酶消化、HCl處理變性雜交洗滌復(fù)染操作流程簡(jiǎn)圖制片預(yù)處理FISH結(jié)果分析破壞細(xì)胞膜利60A.無(wú)須計(jì)數(shù)的大簇團(tuán)信號(hào)（高度擴(kuò)增）B.顆粒狀信號(hào)（R>10，高度擴(kuò)增）C.須計(jì)數(shù)的顆粒狀信號(hào)（R=3.5，低度擴(kuò)增）ACBHer-2基因擴(kuò)增狀況A.無(wú)須計(jì)數(shù)的大簇團(tuán)信號(hào)（高度擴(kuò)增）B.顆粒狀信號(hào)（R61Her-2基因無(wú)擴(kuò)增情況紅信號(hào)數(shù)>2，同時(shí)綠信號(hào)非整倍體R<1.8，無(wú)擴(kuò)增紅信號(hào)與綠信號(hào)均為兩點(diǎn)，R=1Her-2基因無(wú)擴(kuò)增情況紅信號(hào)數(shù)>2，同時(shí)綠信號(hào)非整倍體R<62>30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜高強(qiáng)度著色免疫組化（3+）與FISH對(duì)比圖×40×100住院號(hào)：177319浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌Ⅱ級(jí)IHC：+++FISH：呈簇團(tuán)狀高度擴(kuò)增×100>30%的腫瘤細(xì)胞全部免疫組化（3+）與FISH對(duì)比圖×463免疫組化（2+）與FISH對(duì)比圖1.>30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜弱至中等著色×40住院號(hào)：175465浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌Ⅱ級(jí)IHC：++FISH：Ratio>5，中度擴(kuò)增×100免疫組化（2+）與FISH對(duì)比圖1.>30%的