分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-第四章省名師優(yōu)質(zhì)課賽課獲獎(jiǎng)?wù)n件市賽課百校聯(lián)賽優(yōu)質(zhì)課一等獎(jiǎng)?wù)n件

1/57第四章目標(biāo)基因獲取目標(biāo)基因：準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表示基因。2/57第一節(jié)

基因組DNA片斷化一、限制性內(nèi)切酶法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不一樣大小片斷。酶切3/57因?yàn)閹в姓承阅┒?，產(chǎn)物能夠直接與載體連接。1.優(yōu)點(diǎn)2.缺點(diǎn)目標(biāo)基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶切點(diǎn)。目標(biāo)基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene4/57二、隨機(jī)片斷化1.限制性內(nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶用量和消化時(shí)間，使基因組中酶切位點(diǎn)只有一部分被隨機(jī)切開。①內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)堿基數(shù)影響所切出產(chǎn)物長(zhǎng)度和隨機(jī)程度。（1）限制性內(nèi)切酶選取標(biāo)準(zhǔn)5/571）4bp內(nèi)切酶平均每46（4096）bp一個(gè)切點(diǎn)。2）6bp內(nèi)切酶平均每44（256）bp一個(gè)切點(diǎn)。隨機(jī)程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②內(nèi)切酶粘性末端能與慣用克隆位點(diǎn)相連。（Sau3A—BamHI）6/572.機(jī)械切割法（1）超聲波超聲波強(qiáng)烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp隨機(jī)片斷。（2）高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb隨機(jī)片斷。7/571976年H.G.Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因構(gòu)想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因論文。第二節(jié)

化學(xué)合成目標(biāo)基因一、當(dāng)前慣用方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動(dòng)化合成法。8/57①

保護(hù)dNTP5’端P或3’端-OH③

用酸或堿脫保護(hù)（1）原理1.磷酸二酯法②

帶保護(hù)單核苷酸連接確保合成反應(yīng)定向進(jìn)行。帶5’保護(hù)單核苷酸與帶3’保護(hù)另一個(gè)單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來(lái)。9/57（2）合成過(guò)程下一個(gè)5’端保護(hù)單核苷酸又能夠同3’端保護(hù)二核苷酸聚合。10/57原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應(yīng)單核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先連接了一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。2.磷酸三酯法11/57

將第一個(gè)核苷酸3’-OH端固定在固相支持物上。

固相磷酸三酯合成法是當(dāng)前通用合成方法。15合成二核苷酸連接處有三個(gè)酯鍵！12/57固相磷酸三酯合成過(guò)程固相支持物結(jié)果是全保護(hù)DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之間對(duì)氯苯。最終脫保護(hù)固相支持物固相支持物C13/57化學(xué)合成DNA片斷普通在200bp以內(nèi)。二、

化學(xué)合成DNA片斷組裝用T4多核苷酸激酶使各個(gè)片段5’端帶上磷酸。1.互補(bǔ)連接法預(yù)先設(shè)計(jì)合成片斷之間都有互補(bǔ)區(qū)域，不一樣片斷之間互補(bǔ)區(qū)域能形成有斷點(diǎn)完整雙鏈。（2）5’端磷酸化（1）互補(bǔ)配對(duì)（合成DNA單鏈5’端是-OH）14/57T4DNA連接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整DNA雙鏈（3）連接酶連成完整雙鏈15/572.互補(bǔ)延伸連接法預(yù)先設(shè)計(jì)片斷之間有局部互補(bǔ)區(qū)，能夠相互作為另一個(gè)片斷延長(zhǎng)引物，用DNA聚合酶延伸成完整雙鏈。3’

5’

5’

3’

5’

3’

T4DNA連接酶Klenow片段引物16/571.直接合成基因三、

寡聚核苷酸化學(xué)合成優(yōu)點(diǎn)2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA含量很低，極難作cDNA

3.合成探針序列4.定點(diǎn)突變合成合成帶有定點(diǎn)突變基因片斷。（2）有些基因比較短，化學(xué)合成費(fèi)用較低17/57DNA合成儀5.合成人工接頭或銜接物含有各種酶切位點(diǎn)人工接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor18/57

將某種生物細(xì)胞整個(gè)基因組DNA切割成大小適當(dāng)片斷，并將全部這些片斷都與適當(dāng)載體連接，引入對(duì)應(yīng)宿主細(xì)胞中保留和擴(kuò)增。

理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體全部基因，稱為基因文庫(kù)。一、基因文庫(kù)構(gòu)建1.基因文庫(kù)（genelibrary）第三節(jié)

目標(biāo)基因保留和擴(kuò)增19/57（2）當(dāng)前慣用載體

2.構(gòu)建基因文庫(kù)載體選取載體能夠容載DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整基因文庫(kù)所需要重組子數(shù)目。載體容量越大，所要求DNA片斷數(shù)目越少，所需重組子越少。（1）對(duì)載體要求

載體系列：

容量為24kpcosmid載體：

容量為50kbYAC：

容量為1MbBAC:容量為300kb20/57斷點(diǎn)完全隨機(jī)，片斷長(zhǎng)度適當(dāng)于載體連接。不能用普通限制性內(nèi)切酶消化法。（1）染色體DNA大片段制備3.基因文庫(kù)構(gòu)建普通步驟超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）。

①

物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化。可得到10-30kb隨機(jī)片斷。②

酶切法：21/57（2）載體與基因組DNA大片段連接①

粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段兩個(gè)末端都有相同粘性末端。如：Sau3A與BamHI酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。②人工接頭法（adapter）人工合成限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。22/57各種酶接頭能夠向企業(yè)定做或購(gòu)置。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾23/5724/574.基因組文庫(kù)大小一個(gè)文庫(kù)要包含99%基因組DNA時(shí)所需要克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫(kù)包含了整個(gè)基因組DNA概率（99%）f:插入載體DNA片斷平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因組DNA百分?jǐn)?shù)N：所需重組載體數(shù)（克隆數(shù)）25/57比如：人基因組是3×109bp，插入DNA片斷平均長(zhǎng)度假如是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×10526/571.cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出DNA稱cDNA。2.cDNAlibrary二、cDNA文庫(kù)構(gòu)建mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物利用某種生物總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保留和擴(kuò)增，稱cDNA文庫(kù)。27/57（1）不含內(nèi)含子序列。（2）能夠在細(xì)菌中直接表示。（3）包含了全部編碼蛋白質(zhì)基因。（4）比DNA文庫(kù)小多，輕易構(gòu)建。4.構(gòu)建cDNA文庫(kù)普通步驟（1）總RNA（totalRNA）提取3.cDNA文庫(kù)特點(diǎn)提取總RNA有商業(yè)化試劑盒（kit）。28/57分離mRNA用商業(yè)化OligodT纖維柱。

利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA1%-2%。（2）mRNA分離純化①原理②mRNA分離純化Column（柱）29/5730/57反轉(zhuǎn)錄酶（3）cDNA合成①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。用OligodT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA第一鏈。

mRNAcDNA3’

5’

5’

AAAAAAATTTTTTTOligodT引物31/57用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一鏈3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH堿32/57剩下cDNA單鏈3’末端普通形成一個(gè)彎回來(lái)雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。cDNA第一鏈5’

cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

③cDNA第二鏈合成33/57④去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸酶S1用核酸酶S1能夠切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)造成cDNA中有用序列被切掉?。?。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

5’

3’

34/5735/57這種酶能識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中mRNA，并將其降解成許多小片斷。妙用RNaseH小片斷恰好成為DNA聚合酶引物，用來(lái)合成岡崎片斷。DNAPolI除去引物并修補(bǔ)后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。36/57mRNAcDNA3’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

5’

引物mRNAcDNA第一鏈3’

5’

mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’

5’

RNaseHDNAligase去引物37/5738/57在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌?；蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA3’端分別加上幾個(gè)C或G，成為粘性末端。5.cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶39/5740/576.cDNA文庫(kù)大小一個(gè)cDNA文庫(kù)要包含99%mRNA時(shí)所需要克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫(kù)包含了完整mRNA概率（99%）:某一個(gè)低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細(xì)胞整個(gè)mRNA百分比N：所需重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n1n41/57三、文庫(kù)查詢（screening）用目標(biāo)基因探針與文庫(kù)中重組載體進(jìn)行Southernblot雜交。文庫(kù)載體探針電泳后雜交放射自顯影測(cè)序分析42/57第四節(jié)

目標(biāo)基因分離和擴(kuò)增一、目標(biāo)基因分離1.探針柱分離特異mRNA依據(jù)已知基因序列合成探針，結(jié)合到纖維素柱上，用來(lái)分離純化該基因mRNA。富集特定基因mRNA或cDNA模板。43/57纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNATotalmRNA纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA過(guò)柱與探針堿基互補(bǔ)mRNA結(jié)合到柱上，其它mRNA流走。特異mRNA洗脫RT-PCR44/572.mRNA消解雜交原理：羥基磷灰石柱結(jié)合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。（Hydroxylapatitecolumn）45/57從表示A蛋白和不表示A蛋白組織細(xì)胞中分別提取和分離總mRNA。將表示A蛋白mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表示A蛋白總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交cDNA就包含特異表示A基因cDNA單鏈。用羥磷灰石柱搜集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測(cè)序。46/57AAA組織B組織總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白AmRNA不含蛋白AmRNA總cDNA第一鏈A雜交內(nèi)含蛋白AcDNA羥磷灰石柱過(guò)柱吸收RNA-DNA單鏈濾過(guò)羥磷灰石柱BAPCR16cDNA文庫(kù)47/573.mRNA差異顯示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR（1）3’端錨定引物Oligo(dT)引物3’端加兩個(gè)核苷酸（倒數(shù)第二個(gè)不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’

3’

48/57（2）12種錨定引物AGTTTTTTTT5’

3’

CGTTTTTTTT5’

3’

GGTTTTTTTT5’

3’

TGTTTTTTTT5’

3’

AATTTTTTTT5’

3’

CATTTTTTTT5’

3’

GATTTTTTTT5’

3’

TATTTTTTTT5’

3’

ACTTTTTTTT5’

3’

CCTTTTTTTT5’

3’

GCTTTTTTTT5’

3’

TCTTTTTTTT5’

3’

49/57（3）5’端隨即引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTT5’

3’

擴(kuò)增cDNA第一鏈。RTNMTTTTTTTT5’

cDNA3’

NNNNNNNNNN5’

3’

NNNNNNNN