氨基酸的分離鑒定-紙層析法課件

生物化學(xué)實驗教案生化小老師一組生物化學(xué)實驗室生化小老師團隊生物化學(xué)實驗教案生物化學(xué)實驗室生化小老師團隊氨基酸的分離鑒定——紙層析法3，5—二硝基水楊酸比色法測還原糖和總糖含量氨基酸的分離鑒定——紙層析法3，5—二硝基水楊酸比色法測還原氨基酸的分離鑒定——紙層析法實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒炘噭┡c儀器實驗步驟注意事項實驗結(jié)果與分析氨基酸的分離鑒定——紙層析法實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒炘噭┡c儀器實實驗?zāi)康?掌握氨基酸紙層析法的原理2熟悉紙層析法的實驗操作3分離鑒別未知氨基酸樣品的成分。實驗?zāi)康?掌握氨基酸紙層析法的原理2熟悉紙層析法的實驗操作3實驗原理紙層析紙層析法屬于分配層析，層析濾紙為載體，流動相是指層析液，在毛細拉力作用下，層析液能不斷由下向上流動。固定相是指被吸附在濾紙纖維之間的水分。由于纖維素上的羥基具親水性使這部分水束縛在纖維素周圍，不易擴散而成為固定相。實驗原理紙層析實驗原理在層析過程中，當(dāng)層析液在毛細拉力作用下，上升流經(jīng)濾液滴點時，滴點上的氨基酸就相繼融入層析液，隨著層析液上升，并發(fā)生在分配，即有一部分色素從層析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系數(shù)的不同，那些分配系數(shù)大的氨基酸分子，隨層析液向上移動得快，形成的斑點集中在濾紙的上部；而分配系數(shù)小的氨基酸分子，隨層析向上移動得慢，形成的斑點集中在濾紙的下面。實驗原理在層析過程中，當(dāng)層析液在毛細拉力作用下，上升流經(jīng)濾液實驗原理分配系數(shù)指一定溫度下,處于平衡狀態(tài)時，組分在固定相中的濃度和在流動相中的濃度之比，以K表示。分配系數(shù)反映了溶質(zhì)在兩相中的遷移能力及分離效能，是描述物質(zhì)在兩相中行為的重要物理化學(xué)特征參數(shù)。在同一實驗條件下，比移值Rf主要取決于分配系數(shù)，不同的物質(zhì)分配系數(shù)不同，也就有不同的Rf。此外，溶劑的溶質(zhì)的性質(zhì)、濾紙的性質(zhì)、展層的溫度和pH值均會影響比移值Rf。在層析過程中，當(dāng)層析液在毛細拉力作用下，上升流經(jīng)濾液滴點時，滴點上的氨基酸就相繼融入層析液，隨著層析液上升，并發(fā)生在分配，即有一部分色素從層析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系數(shù)的不同，那些分配系數(shù)大的氨基酸分子，隨層析液向上移動得快，形成的斑點集中在濾紙的上部；而分配系數(shù)小的氨基酸分子，隨層析向上移動得慢，形成的斑點集中在濾紙的下面。Rf=原點到層析斑點中心的距離原點到溶劑前沿的距離實驗原理分配系數(shù)原點到層析斑點中心的距離原點到溶劑前沿的距離實驗原理茚三酮的顯色原理氨基酸與茚三酮水合物在弱酸條件下共加熱時，氨基酸被氧化脫氨、脫羧，而茚三酮水合物被還原，其還原物可與氨基酸加熱分解產(chǎn)生的氨結(jié)合，再與另一分子茚三酮縮合成為藍紫色化合物，稱為羅曼紫（Ruhemann'spurple）。實驗原理茚三酮的顯色原理實驗試劑與儀器試劑

純凈的賴氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸8×10E-3mol/L溶液；四種氨基酸混合溶液（每種濃度與對應(yīng)純凈溶液一致）；2.5%茚三酮丙酮溶液；酸性展層劑（正丁醇：88%甲酸：水=60：17：8）。儀器

鐘罩×1、培養(yǎng)皿×1、小燒杯10ml×1、層析柱×1、小漏斗×1、新華一號濾紙（14cm×17cm）×1、電吹風(fēng)、烘箱、毛細管、訂書機，及其他常用儀器。實驗試劑與儀器試劑實驗步驟點樣平衡層析顯色實驗步驟點樣平衡層析顯色點樣取潔凈濾紙一張，在距底邊2cm線上取五個點（每兩點相隔距離2cm），分別用毛細管將各氨基酸樣品點在五個點上，點樣大小以直徑3mm左右為宜，不要超過5mm，冷風(fēng)吹干，重復(fù)點樣一次，吹干。實驗步驟點樣實驗步驟實驗步驟平衡將濾紙卷成柱狀將兩邊緣對齊（注意不要讓兩端接觸，造成層析液上升高度不一致），并用訂書機訂好，將濾紙豎直放置在潔凈的培養(yǎng)皿中（不要接觸培養(yǎng)皿壁），旁邊擺放一個內(nèi)盛展開劑的小燒杯，蓋上鐘罩平衡30min。實驗步驟平衡實驗步驟層析平衡結(jié)束后，打開鐘罩上端塞子，通過已潤洗的“漏斗—層析柱”裝置向培養(yǎng)皿內(nèi)加入展層劑30～40ml至液面達到培養(yǎng)皿2/3處為宜（層析柱不能碰到濾紙），小心抽出裝置（不要讓層析液滴落在濾紙上），蓋上塞子開始層析，直到前沿達到距濾紙上端1cm刻線處（此過程2～3小時）。實驗步驟層析實驗步驟顯色取出層析好的濾紙（需帶手套），拆開訂書釘，用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。將濾紙放入烘箱烘烤5min左右，待顯色后取出。用鉛筆輕輕描出顯色斑點的形狀，找到中心點，測出中心點與原點水平線的距離，計算各種氨基酸的比移值Rf，判斷混合點上端各點是什么氨基酸。實驗步驟顯色注意事項1.整個操作過程需帶手套進行，不要對著濾紙說話，以免濾紙被污染。2.點樣時應(yīng)注意毛細管的取放，以免污染試劑。3.點樣吹干時不宜吹得過干。4.柱狀濾紙邊緣盡量保持豎直，邊緣的坡度會影響層展的速率及效果。訂的釘子上下各兩顆為宜。注意事項1.整個操作過程需帶手套進行，不要對著濾紙說話，以實驗結(jié)果及分析——圖像實例實驗結(jié)果及分析——圖像實例——各氨基酸比移值Rf實驗結(jié)果及分析氨基酸賴氨酸天冬氨酸丙氨酸亮（白）氨酸Rf0.22940.38140.57710.8609在同一實驗條件下，比移值Rf主要取決于分配系數(shù)，不同的物質(zhì)分配系數(shù)不同，也就有不同的Rf。此外，溶劑的溶質(zhì)的性質(zhì)、濾紙的性質(zhì)、展層的溫度和pH值均會影響比移值Rf。實驗中，Rf值與個人操作及具體實驗條件息息相關(guān)，存在一定波動，但總體趨勢相同。——各氨基酸比移值Rf實驗結(jié)果及分析氨基酸賴氨酸天冬氨酸丙氨——思考問題實驗結(jié)果及分析層析過程中，濾紙上前沿會出現(xiàn)些許黃色物質(zhì)，你認為這是什么？為生整個實驗過程需要戴手套進行？簡述你認為怎樣點樣可以得到較小斑點。為什么要平衡？——思考問題實驗結(jié)果及分析層析過程中，濾紙上前沿會出現(xiàn)些許黃3，5—二硝基水楊酸比色法測還原糖和總糖含量實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒炘噭┡c儀器實驗步驟實驗結(jié)果及分析注意事項3，5—二硝基水楊酸比色法測還原糖和總糖含量實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒災(zāi)康囊徽莆誅NS比色法測定糖含量的原理二熟練比色法測糖的基本操作三掌握分光光度計的使用方法實驗?zāi)康囊徽莆誅NS比色法測定糖含量的原理二熟練比色法測糖的實驗原理還原糖在堿性條件下加熱被3，5—二硝基水楊酸（DNS）氧化成糖酸及其他產(chǎn)物，3，5—二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3—氨基—5—硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比例關(guān)系，利用分光度計，在540nm波長下測定光密度值，測繪并查對標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算還原糖及總糖含量實驗原理還原糖在堿性條件下加熱被3，5—二硝基水楊酸（DNS實驗原理實驗原理實驗試劑與儀器小麥面粉3，5—二硝基水楊酸（DNS試劑）：將6.3gDNS和262mL2mol/LNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液

準(zhǔn)確稱取80℃烘至恒重的分析純葡萄糖100mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，混勻，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?碘化鉀溶液、酚酞試劑、6mol/LHCL及6mol/LNaOH溶液主要試劑：實驗試劑與儀器小麥面粉主要試劑：實驗試劑與儀器具塞玻璃刻度試管：20mL×10、普通小試管2只、離心管：10mL×2、容量瓶：50mL×1，100ml×1、吸量管：1mL×1；2mL×2、點滴板、恒溫水浴鍋、離心機、電子天平、分光光度計、膠頭滴管、玻璃棒等其他常規(guī)儀器。主要儀器：實驗試劑與儀器具塞玻璃刻度試管：20mL×10、普通小試管2實驗步驟還原糖的提取：稱取0.30g小麥面粉于試管中加入5ml左右蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?0℃水浴20min水浴后，將所有溶液轉(zhuǎn)移至離心管中（應(yīng)盡量將試管洗滌干凈），以4000r/min轉(zhuǎn)速離心5min將上層清液倒入50ml容量瓶中，向盛有固體的離心管中加入適量蒸餾水重新使固液混勻，重復(fù)上步操作進行二次離心將上層清液倒入50ml容量瓶中，定容至50ml，即得到還原糖樣品待測溶液實驗步驟還原糖的提取：稱取0.30g小麥面粉于試管中加入5m實驗步驟稱取0.10g面粉于試管中，加入1.5ml蒸餾水和1.0ml6mol/L鹽酸，搖勻，沸水浴30min水浴后，可用碘—碘化鉀試劑檢驗淀粉是否水解完全，水解完全后，滴入一滴酚酞試劑，用NaOH溶液滴定至溶液微紅將溶液容至100ml，即得到總糖樣品待測溶液總糖的提?。簩嶒灢襟E稱取0.10g面粉于試管中，加入1.5ml蒸餾水和1實驗步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的測繪及還原糖和總糖含量的測定：1234567、8(還原糖）9、10（總糖）葡萄糖溶液或待測溶液（ml)00.20.40.60.81.02.00.5蒸餾水（ml)2.01.81.61.41.21.001.5DNS(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.5震蕩搖勻溶液，沸水浴5min,冷卻后定容至20ml，上下顛倒混勻，放置約20min將上表中各溶液用分光光度計測量吸光度，用1～6號試管數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將7、8、9、10號試管所得吸光度和繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，計算還原糖和總糖的平均含量。實驗步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的測繪及還原糖和總糖含量的測定：123456實驗結(jié)果及分析計算公式：×××××實驗結(jié)果及分析計算公式：×××××實驗結(jié)果及分析——參考實例還原糖：5.13%總糖：82.7%實驗結(jié)果及分析——參考實例還原糖：5.13%實驗結(jié)果及分析——思考問題提取還原糖步驟中為什么要離心？為什么總糖