氮限制對(duì)赤潮微藻生長(zhǎng)的影響

氮限制對(duì)赤潮微藻生長(zhǎng)的影響

1浮游植物的生態(tài)特性氮（n）是浮游植物生長(zhǎng)最必要的養(yǎng)分之一，也是浮游植物生長(zhǎng)最常見的限制因素（vitokandzhong，1991）。然而，隨著近海沿岸氮污染的加劇，許多近海沿岸浮游植物的生長(zhǎng)沒有受到氮的限制（t社會(huì)學(xué)，1998；wandchu，2003；wangetal，2009）。然而，豐富的氮源顯著增加了浮游生物的生物量。浮游生物，尤其是小型藻類廣泛繁殖，能消耗水中原始的氮元素，水體中的氮元素不足，浮游生物的生長(zhǎng)受到臨時(shí)nn限制（riegan，1995）。不同赤潮藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的需求存在差異,它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的利用和營(yíng)養(yǎng)鹽限制的承受能力是其種間競(jìng)爭(zhēng)重要的生態(tài)策略(Vuorioetal.,2005).雖然目前已有諸多報(bào)道研究了在實(shí)驗(yàn)室條件下營(yíng)養(yǎng)鹽限制對(duì)某一單種藻類生長(zhǎng)的影響(JohnandFlyn,2000;劉東艷等,2002;呂頌輝等,2006),以及海洋浮游植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)失衡的響應(yīng)(Andersonetal.,2002;HodgkissandLu,2004;Vuorioetal.,2005),但有關(guān)混合培養(yǎng)條件下營(yíng)養(yǎng)鹽限制對(duì)不同類型浮游植物生長(zhǎng)和種間競(jìng)爭(zhēng)影響的報(bào)道尚較少.因此,本研究選擇了我國(guó)海域重要的3種赤潮藻類:無(wú)毒無(wú)害硅藻中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)、無(wú)毒有害甲藻錐狀斯氏藻(Scrippsiellatrochoidea)以及有毒有害針孢藻海洋卡盾藻(Chattonellamarina)作為實(shí)驗(yàn)材料,研究了N限制對(duì)其生長(zhǎng)以及種間競(jìng)爭(zhēng)的影響,以了解不同類別的赤潮藻類對(duì)N限制的響應(yīng),揭示我國(guó)沿海海域富營(yíng)養(yǎng)化與有毒有害赤潮發(fā)生的關(guān)系.2材料和方法表面活性劑2.1培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法中肋骨條藻(Sc)、錐狀斯氏藻(St)和海洋卡盾藻(Cm)采自南海大亞灣海域,并在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離、純化,培養(yǎng)于暨南大學(xué)水生生物研究所的藻種室.從藻種室接種并擴(kuò)大培養(yǎng)于新鮮的培養(yǎng)基中.實(shí)驗(yàn)前,接種3～4次使細(xì)胞達(dá)到同步培養(yǎng).藻種馴化培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的N、磷(P)、硅(Si)營(yíng)養(yǎng)元素濃度采用大亞灣養(yǎng)殖區(qū)自然海水水平,濃度分別設(shè)置為500μg·L-1(N)、74μg·L-1(P)、1000μg·L-1(Si),培養(yǎng)基中的N、P、Si分別由NaNO3、NaH2PO4、NaSiO3配制,其余元素與f/2培養(yǎng)基中相同.培養(yǎng)基所用人工海水由RedcoralSea牌無(wú)氮無(wú)磷海鹽配制,pH值為7.9±0.1,鹽度為31～33,經(jīng)測(cè)定配制的人工海水中N、P水平為未檢出.人工海水、培養(yǎng)基母液通過(guò)121℃高壓蒸汽滅菌20min后,在無(wú)菌操作臺(tái)中配制.所用容器等均經(jīng)過(guò)高壓滅菌后使用.培養(yǎng)在溫度為(20±1)℃、光照約為60μE、光暗比為12h∶12h的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng).實(shí)驗(yàn)時(shí),在250mL三角瓶?jī)?nèi)盛150mL培養(yǎng)基,接種0.5mL處于對(duì)數(shù)期的藻細(xì)胞,使實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液里初始細(xì)胞密度為600cells·mL-1左右,整個(gè)實(shí)驗(yàn)為一次性培養(yǎng),各實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)重復(fù).2.2np的表征設(shè)置3個(gè)N、P濃度梯度,對(duì)照組(C)的N、P含量根據(jù)大亞灣海水中最高N、P含量進(jìn)行設(shè)置,分別為500μg·L-1(N)和74μg·L-1(P),N∶P接近Redfield比值(15∶1,原子比);兩個(gè)N限制組(N1、N2)的營(yíng)養(yǎng)鹽含量是在P含量保持不變的情況下,改變N含量(分別為100和10μg·L-1),使N∶P原子比分別下降至3∶1和0.3∶1.除N、P濃度按實(shí)驗(yàn)規(guī)定設(shè)置外,實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液中的其余元素同2.1節(jié).分別設(shè)置3種藻單種培養(yǎng)組(Sc組、St組、Cm組)、兩兩混合組(St+Sc組、St+Cm組、Sc+Cm組)和3種混合組(Sc+St+Cm組).2.3藻細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行了29d,實(shí)驗(yàn)前10d每2d計(jì)數(shù)1次,實(shí)驗(yàn)中期(10～22d)每隔4d計(jì)數(shù)1次,最后1次計(jì)數(shù)是在7d后的29d.藻細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí),根據(jù)藻細(xì)胞的密度吸取藻培養(yǎng)液50μL,置于1mL計(jì)數(shù)框內(nèi),并用1滴甲醛固定,在OLYMPUSCX31顯微鏡下計(jì)數(shù)藻細(xì)胞和孢囊數(shù)目,并觀察藻種的細(xì)胞形態(tài).中肋骨條藻因細(xì)胞體積較小,根據(jù)其密度水平采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)或用lmL計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù).2.4計(jì)算的分析2.4.1兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的形成率由于孢囊是營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行有性生殖的產(chǎn)物,一個(gè)孢囊形成需要兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞融合,因此計(jì)算孢囊形成率時(shí),將一個(gè)孢囊計(jì)算為兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,孢囊形成率用公式(1)進(jìn)行計(jì)算(OlliandAnderson,2002;Wangetal.,2007):C=2C/(2C+N)×100%(1)式中,C為錐狀斯氏藻孢囊數(shù)量,N為錐狀斯氏藻營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量.2.4.2培養(yǎng)中下環(huán)境預(yù)容量比的確定在種群生態(tài)學(xué)中,環(huán)境容納量(K)是指特定環(huán)境所能容許的種群數(shù)量的最大值.環(huán)境容納量是環(huán)境制約作用的具體體現(xiàn),有限的環(huán)境只能為有限生物的生存提供所需的資源,在本實(shí)驗(yàn)中的環(huán)境容納量即最大細(xì)胞密度.因此,本文將環(huán)境制約條件下的環(huán)境容納量與相應(yīng)因子不受制約條件下環(huán)境容納量的比值,稱為相對(duì)環(huán)境容納量(K′),見式(2),以比較環(huán)境制約(N限制與種間競(jìng)爭(zhēng))對(duì)種群增長(zhǎng)的影響.K′=Kt/Kc×100%(2)式中,K′為各實(shí)驗(yàn)組某一種藻的相對(duì)環(huán)境容納量,Kt為實(shí)驗(yàn)組中該藻的最大細(xì)胞密度(環(huán)境容納量),Kc為同樣N濃度條件下單種培養(yǎng)時(shí)該藻的環(huán)境容納量;如果計(jì)算N限制組(N1、N2組)某一種藻單種培養(yǎng)時(shí)的相對(duì)環(huán)境容納量,則Kc為該藻單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)對(duì)照組(C組)的環(huán)境容納量.同樣也計(jì)算了各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)孢囊形成率見式(3):C′=Ct/Cc×100%(3)式中,C′為各實(shí)驗(yàn)組錐狀斯氏藻的相對(duì)孢囊形成率,Ct為實(shí)驗(yàn)組中的最大孢囊形成率,Cc為同樣N濃度條件下單種培養(yǎng)時(shí)的最大孢囊形成率;如果計(jì)算N限制組(N1、N2組)錐狀斯氏藻單種培養(yǎng)的相對(duì)孢囊形成率,則Cc為C組單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)錐狀斯氏藻最大孢囊形成率.2.5統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)的平均值,數(shù)據(jù)誤差線為3組數(shù)據(jù)間標(biāo)準(zhǔn)差.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行顯著性差異分析.3結(jié)果結(jié)果3.1n限制對(duì)骨條藻和海洋卡盾藻生長(zhǎng)的影響圖1為單獨(dú)培養(yǎng)時(shí),3種藻在不同N限制條件下的生長(zhǎng)曲線.N限制對(duì)3種赤潮藻類的生長(zhǎng)均具有明顯的影響(p<0.05),而N1、N2兩個(gè)N限制組之間沒有顯著差異(p>0.05).在N源充足的情況下,中肋骨條藻和錐狀斯氏藻能快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞密度迅速增長(zhǎng),而在N限制條件下,則生長(zhǎng)緩慢(圖1a\,b).N限制條件下,海洋卡盾藻的生長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照組基本相近,經(jīng)過(guò)了2～4d的遲滯期后,細(xì)胞密度緩慢增長(zhǎng)(圖1c).相對(duì)來(lái)說(shuō),N限制對(duì)骨條藻生長(zhǎng)影響最為明顯,N1和N2組的相對(duì)環(huán)境容納量?jī)H為C組的25%左右,錐狀斯氏藻和海洋卡盾藻的相對(duì)環(huán)境容納量分別為40%和70%左右(表1).3.2與中軟骨條藻細(xì)胞的環(huán)境預(yù)困境狀p圖2至圖4顯示了在兩種藻類混合培養(yǎng)條件下,3種赤潮藻類的生長(zhǎng)狀況.在混合培養(yǎng)條件下,N限制仍然明顯影響藻細(xì)胞生長(zhǎng)(p<0.05或<0.01),特別是在培養(yǎng)初期影響更為明顯.兩兩混合培養(yǎng)時(shí),錐狀斯氏藻和海洋卡盾藻的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本上與單種培養(yǎng)相近,但藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到種間競(jìng)爭(zhēng)的明顯抑制(p<0.01),具體表現(xiàn)為環(huán)境容納量明顯下降.與單種培養(yǎng)相比,錐狀斯氏藻相對(duì)環(huán)境容納量介于42.7%～70.0%,而海洋卡盾藻則為25.6%～61.0%之間(表1).在與中肋骨條藻的競(jìng)爭(zhēng)中,錐狀斯氏藻和海洋卡盾藻均處于劣勢(shì),兩種藻細(xì)胞的環(huán)境容納量均下降了50%以上(表1);而錐狀斯氏藻與海洋卡盾藻的種間競(jìng)爭(zhēng)能力相當(dāng),兩種混合培養(yǎng)相對(duì)環(huán)境容納量為60%～70%左右,相對(duì)來(lái)說(shuō)錐狀斯氏藻更具競(jìng)爭(zhēng)力.在兩兩混合培養(yǎng)體系中,中肋骨條藻的生長(zhǎng)曲線與單種培養(yǎng)具有較明顯的差異(圖2a,圖3a),藻細(xì)胞首先經(jīng)過(guò)一個(gè)快速增長(zhǎng)期,細(xì)胞密度迅速增加,在其他兩種藻類快速生長(zhǎng)的第8～10d,中肋骨條藻細(xì)胞密度出現(xiàn)了下降趨勢(shì),并維持較低細(xì)胞密度至第18～22d,隨后細(xì)胞密度又出現(xiàn)一定程度的增長(zhǎng),并達(dá)到其最大細(xì)胞密度.在不同N限制下,除個(gè)別混合培養(yǎng)組外,中肋骨條藻的環(huán)境容納量并未見明顯下降(p>0.05),相對(duì)環(huán)境容納量一般超過(guò)80%(表1).3.33種藻混合培養(yǎng)體系對(duì)中骨折條藻生長(zhǎng)的影響在3種藻混合培養(yǎng)條件下,N限制對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)仍具有明顯影響,同樣中肋骨條藻對(duì)N限制最為敏感(圖5),但在培養(yǎng)后期N限制組的藻細(xì)胞密度與對(duì)照組基本上不具明顯區(qū)別(p<0.05).說(shuō)明3種藻混合培養(yǎng)體系中,種間競(jìng)爭(zhēng)已經(jīng)成為藻細(xì)胞生長(zhǎng)的決定性因素.與兩種藻混合培養(yǎng)不同,中肋骨條藻在3種藻混合培養(yǎng)體系中的生長(zhǎng)受到極大程度的抑制,環(huán)境容納量比單種培養(yǎng)時(shí)下降了90%左右,相對(duì)環(huán)境容納量?jī)H為8.3%～14.6%(表1),說(shuō)明骨條藻在與其他兩種赤潮藻共存時(shí),競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)大幅度降低.相反,在3種藻混合培養(yǎng)體系中,錐狀斯氏藻和海洋卡盾藻的生長(zhǎng)雖然劣于單種培養(yǎng),但生長(zhǎng)狀況和環(huán)境容納量與兩種藻混合培養(yǎng)狀況相近,甚至更佳(圖2\,圖3\,圖5\,表1).說(shuō)明在3種藻的混合培養(yǎng)體系中,錐狀斯氏藻和海洋卡盾藻能對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生聯(lián)合抑制效應(yīng),較大程度地抑制了中肋骨條藻的生長(zhǎng).3.4種檢測(cè)方法混合培養(yǎng)體系中孢囊的形成率錐狀斯氏藻是極易形成孢囊的種類,在本實(shí)驗(yàn)中孢囊的最終形成率為52.3%～89.5%(圖6).孢囊一般在藻細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期后的第10d左右形成,N限制以及種間競(jìng)爭(zhēng)能促進(jìn)孢囊的提前形成,在N限制組和混合培養(yǎng)體系中,孢囊可在培養(yǎng)的第6d開始形成.N限制不能明顯促進(jìn)孢囊形成率的提高,種間競(jìng)爭(zhēng)能較大幅度促進(jìn)孢囊的形成(p<0.05),混合培養(yǎng)體系中孢囊的相對(duì)形成率可達(dá)118.1%～170.4%(表1),特別是在競(jìng)爭(zhēng)激烈的3種藻混合培養(yǎng)體系中,大部分錐狀斯氏藻更以休眠孢囊的形式來(lái)逃避種間競(jìng)爭(zhēng)壓力.4討論4.1中小型藻類優(yōu)勢(shì)種的確定在本研究中,N限制可明顯影響3種赤潮微藻的生長(zhǎng),而在N充足的情況下,藻細(xì)胞生長(zhǎng)良好.結(jié)果說(shuō)明,近岸海域大量的N輸入是海洋微藻快速繁殖、初級(jí)生產(chǎn)力上升的物質(zhì)基礎(chǔ).如在南海大亞灣海域,近十幾年來(lái)N含量急劇上升,1990年代后期以來(lái)可溶性無(wú)機(jī)N含量增長(zhǎng)了4倍,與此同時(shí)N∶P上升了近20倍(彭云輝等,2002),其結(jié)果導(dǎo)致浮游植物細(xì)胞密度上升了10倍,初級(jí)生產(chǎn)力上升了4倍(劉勝等,2006),赤潮的發(fā)生也日趨頻繁(李濤等,2005;Wangetal.,2009).實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示中肋骨條藻對(duì)N限制較為敏感.中肋骨條藻是一種快速生長(zhǎng)的小型硅藻,在其快速生長(zhǎng)過(guò)程中需要消耗大量的營(yíng)養(yǎng)鹽,因此骨條藻對(duì)N限制的敏感性較強(qiáng).此結(jié)果與許多研究報(bào)道以及海洋環(huán)境中的實(shí)際監(jiān)測(cè)結(jié)果一致.一般認(rèn)為,硅藻對(duì)Si和N的需求較高,N限制能抑制小型硅藻的生長(zhǎng);而P和N∶P則對(duì)鞭毛藻類的種群變動(dòng)起重要作用,N∶P比值的下降可促進(jìn)甲藻、針孢藻等鞭毛藻類取代硅藻占據(jù)優(yōu)勢(shì)(HodgkissandLu,2004;Ignatiadesetal.,2007).在近岸海域,隨著N污染加劇,小型硅藻的優(yōu)勢(shì)度上升,我國(guó)大部分近岸海域的優(yōu)勢(shì)種類均為中肋骨條藻等小型硅藻類(吳玉霖等,2004;李艷等,2005;Wangetal.,2009;王雨等,2009).但是隨著硅藻的快速繁殖,營(yíng)養(yǎng)鹽迅速消耗,導(dǎo)致海水中N元素會(huì)受到暫時(shí)性限制,此時(shí)甲藻、針胞藻等鞭毛藻類能利用其對(duì)N限制較強(qiáng)的耐受能力,占據(jù)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì).因此,在自然海洋環(huán)境中,在硅藻水華過(guò)后,常常會(huì)伴隨著鞭毛藻類水華的發(fā)生,這也是富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致有毒有害赤潮頻發(fā)的重要原因(Smayda,2004).4.2微藻生長(zhǎng)的影響在兩種藻類混合培養(yǎng)條件下,中肋骨條藻生長(zhǎng)趨勢(shì)發(fā)生了較為明顯變化,具體表現(xiàn)為培養(yǎng)初期細(xì)胞密度的快速增長(zhǎng)、培養(yǎng)中期的下降以及培養(yǎng)后期的第二次增長(zhǎng)高峰.骨條藻的細(xì)胞大小以及快速增殖特征是混合培養(yǎng)體系中骨條藻生長(zhǎng)曲線改變的重要原因.微藻的體積大小在浮游生物群落的結(jié)構(gòu)、組成及種間相互作用中起著重要作用,個(gè)體小、比表面積大的微藻在對(duì)光照和營(yíng)養(yǎng)鹽的競(jìng)爭(zhēng)中更易占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位(Armstrong,2003).中肋骨條藻在3種微藻中個(gè)體最小(8.4μm長(zhǎng)、6.5μm寬,n=20),為錐狀斯氏藻(23μm長(zhǎng)、21μm寬,n=20)的1/6.6,為海洋卡盾藻(36μm長(zhǎng)、29μm寬,n=20)1/20,但在混合培養(yǎng)體系中,3種微藻的接種密度均為600cells·mL-1.因此,在混合培養(yǎng)體系中,即使在營(yíng)養(yǎng)鹽充裕的C組,中肋骨條藻雖然能利用其快速生長(zhǎng)的特征使細(xì)胞密度得到快速增長(zhǎng),但由于占用的空間生態(tài)位較小,在培養(yǎng)中期細(xì)胞密度均出現(xiàn)了一定程度的下降,直至其他兩種藻細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)或衰亡期后才恢復(fù)生長(zhǎng).在3種藻混合培養(yǎng)體系中,由于錐狀斯氏藻和海洋卡盾藻的協(xié)同作用,中肋骨條藻的生長(zhǎng)受到更顯著的抑制.這種現(xiàn)象與海洋環(huán)境中的赤潮發(fā)生規(guī)律一致,2003年8月在南海大亞灣海域發(fā)生了錐狀斯氏藻和海洋卡盾藻的混合赤潮,持續(xù)了半個(gè)多月時(shí)間,而在此期間硅藻的生長(zhǎng)受到抑制,直至赤潮消亡,硅藻才重新占據(jù)浮游植物群落優(yōu)勢(shì)(李濤等,2005).4.3種間競(jìng)爭(zhēng)對(duì)孢囊形成的影響孢囊在赤潮形成和消亡過(guò)程中具有重要作用,而許多近岸赤潮藻類都具有形成孢囊的能力(VandenHoeketal.,1995).錐狀斯氏藻是一種極易形成孢囊的赤潮藻類,在培養(yǎng)基中其孢囊形成率可以超過(guò)80%(OlliandAnderson;2002;曹宇等,2006).在本研究中錐狀斯氏藻孢囊的形成率也較高,N限制和種間競(jìng)爭(zhēng)能促使孢囊的提前形成,而混合培養(yǎng)體系中的種間競(jìng)爭(zhēng)能明顯提高孢囊的形成率(圖6).結(jié)果說(shuō)明錐狀斯氏藻能通過(guò)孢囊的形成躲避外界不良條件,以保持種群數(shù)量(營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和孢囊)的穩(wěn)定,當(dāng)環(huán)境條件改善時(shí)孢囊的萌發(fā)又可為水體提供大量營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,從而為種群增長(zhǎng)和赤