高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測定海洋藻類色素

高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測定海洋藻類色素

浮游生物是海洋的主要制造商。它在物質(zhì)交換、能量轉(zhuǎn)化、海洋食品網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等基礎(chǔ)環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。浮游藻類色素已被證實為浮游植物分類的重要化學(xué)分類標志物,并被應(yīng)用于傳統(tǒng)顯微鏡鏡檢難以確定的微型浮游藻和由于過濾損失或預(yù)處理易被破壞的微藻種類鑒別中。浮游藻類色素主要分為3類:葉綠素、類胡蘿卜素和藻膽蛋白,其中葉綠素a普遍存在于所有藻類細胞中并被廣泛用作測定生物量的標志物,葉綠素b和葉黃素被認為是綠藻的特征色素,β,β-胡蘿卜素廣泛存在于海洋浮游藻類中,巖藻黃素被認為是硅藻的特征色素;這5種色素對海洋藻類生物量研究具有重要意義。如今,采用高效液相色譜(HPLC)分析色素的方法已廣泛應(yīng)用于調(diào)查研究海洋藻類組成和浮游藻類群生物量,一次運行可分離超過50種色素且具有較好的分離度,實現(xiàn)了自動快速對樣品進行定性定量分析。HPLC分析浮游藻類色素的方法已被應(yīng)用于確定浮游藻種類、評估自然水體中浮游藻生物量和生物多樣性等?，F(xiàn)已發(fā)展多種用于HPLC分離的色譜柱:C8色譜柱、C18色譜柱、C30色譜柱和C16氨基色譜柱。C18色譜柱對極性葉綠素和二乙烯基葉綠素的分離效果不好,C30色譜柱常被用于食品色素分析而在浮游藻類色素分析上有局限性。2011年,Jayaraman等首次使用反相C16氨基色譜柱。C16氨基色譜柱最初是為藥物制備純化和分析而設(shè)計,以其酰胺官能團特有的性質(zhì)使得C16氨基色譜柱在承受高比例含水流動相、分離物質(zhì)極性范圍、洗脫能力等方面優(yōu)于C8色譜柱和C18色譜柱。自然界中色素種類繁多、化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、極性差別大等給HPLC分離帶來了難度。HPLC-MS技術(shù)可以為這類結(jié)構(gòu)類似物提供更多、更有價值的色譜與電子光譜數(shù)據(jù);該技術(shù)可以通過色素質(zhì)荷比的不同和特征離子的差異進行分離和判定目標物質(zhì)。HPLC-MS技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于海洋光合色素分析中。其中,高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-QqQ-MS)系統(tǒng)以其定量精確性成為色素分析的新手段。色素中存在大量的同分異構(gòu)體,比如原脫植基葉綠素與甲基脫植基葉綠素,海膽酮、隱藻黃素與藍藻黃素,角黃素與別藻黃素,β,β-胡蘿卜素、β,ε-胡蘿卜素、ε,ε-胡蘿卜素與β,ψ-胡蘿卜素等。LC-MS定量分析過程中,由于色譜分離原因,一個色譜峰中可能含有幾種不同的組分,即保留時間相同、相對分子質(zhì)量也相同的同分異構(gòu)體,使得這類物質(zhì)的精確定量受到影響。為了消除干擾,串聯(lián)質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式是最佳選擇,SRM模式以組分相對應(yīng)的特征碎片離子作為定量離子,有效消除了干擾組分的影響,從而使得定量更加精確。本文利用HPLC-QqQ-MS的SRM模式建立了5種色素葉綠素a、葉綠素b、β,β-胡蘿卜素、葉黃素和巖藻黃素的定量分析方法,并利用該方法比較了赤潮異彎藻、卡羅藻、微小原甲藻、微擬球藻、蛋白核小球藻、顆石藻、定鞭金藻、中肋骨條藻、威氏海鏈藻和假微型海鏈藻之間物種色素的分布情況。1實驗部分1.1超純水系統(tǒng)試劑TSQQuantumAccess液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國ThermoFisherScientific公司),超純水系統(tǒng)(法國Millipore公司)。葉綠素a(純度>95%)、葉綠素b(純度>90%)、β,β-胡蘿卜素(純度>95%)、葉黃素(純度>75%)、巖藻黃素(純度>95%)、甲醇和乙腈(HPLC級,美國Sigma-Aldrich公司),丙酮(HPLC級,國藥集團化學(xué)試劑有限公司),乙酸銨(HPLC級,美國TEDIA公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2單標準儲備液v/v準確稱取葉綠素a、葉綠素b、β,β-胡蘿卜素、葉黃素和巖藻黃素各1.0mg,分別用丙酮、90%(v/v)丙酮水溶液、氯仿、丙酮和乙醇溶解并定容至10mL棕色容量瓶中,均配制成0.1g/L的單標準儲備液,置于-80℃冰箱中保存。制作工作曲線時,用甲醇將儲備液稀釋成不同濃度的標準溶液。1.3藻種和藻種藻種由浙江省海洋生物工程重點實驗室微藻種質(zhì)庫提供,分離自浙江沿海和膠州灣。選用藻種有甲藻、綠藻、針胞藻、定鞭藻和硅藻。甲藻:卡羅藻(Karlodiniumveneficum)(NMBjah047-1)和微小原甲藻(Prorocentrumminimum)(NMBjah042);綠藻:微擬球藻(Nannochloropsisoceanic)(NMBluh014)和蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)(NMBluh015-1);針胞藻:赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)(NMBRah03-2)和赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)(NMBRah03-2-2);定鞭藻:顆石藻(Pleurochrysissp.)(NMBjih026-1)和定鞭金藻(Prymnesiumsp.)(NMBjih029);硅藻:中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)(NMBguh004-1)、威氏海鏈藻(Thalassiosiraweissflogii)(NMBguh021)和假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)(NMBguh005)。藻種培養(yǎng)在F/2培養(yǎng)基中,置于光暗周期比為12h∶12h的光照培養(yǎng)箱內(nèi),光照強度范圍為40~70μmolquanta/(m2·s),生長溫度為20℃。藻種在指數(shù)生長期末尾收獲約100mL藻種培養(yǎng)液,在弱真空(<0.03MPa)和微光下過濾到0.22μmWhatmanGF/F玻璃纖維濾膜上。濾膜用錫箔紙包裹保存在-80℃下冷凍保存。冷凍的濾膜需在一個月內(nèi)進行色素提取和分析。1.4玻璃質(zhì)量的提取將冷凍的濾膜快速解凍后剪碎放入10mL具塞棕色玻璃試管中,加入2.7mL冷丙酮后在冰水浴中超聲2min,再加入0.3mL的超純水,使丙酮最終含量為90%,將超聲后的玻璃試管放在-20℃冰箱中靜置過夜提取。上機檢測前先于12000r/min下離心10min,取上清液再用聚四氟乙烯(PTFE)濾膜針筒過濾器過濾,去除雜質(zhì)和細胞碎片。檢測時在300μL的檢測樣品中加入300μL0.5mol/L乙酸銨溶液以提高分離度和改善峰形。所有操作均在暗室中的冰盒內(nèi)進行。處理后的樣品必須在48h內(nèi)上機檢測以降低色素降解對結(jié)果的影響。1.5檢測系統(tǒng)及流程色素提取物通過TSQQuantumAccess高效液相色譜系統(tǒng)分離。使用SupelcoDiscoveryC16氨基色譜柱(150mm×4.6mm,粒徑5μm,孔徑18nm),進樣量為10μL,柱溫為30℃;流動相為甲醇(A)、乙腈(B)和0.5mol/L乙酸銨溶液(C),流速為1.0mL/min,按1∶4的分流比進入離子源。線性梯度洗脫程序:0min,80%A,20%C;7min,72%B,20%C;11min,77%B,18%C;19min,85%B,2%C;30min,80%B,20%A;34min,60%B,40%A;36min,80%A,20%C,保持4min;洗脫總時間為40min。樣品室溫度設(shè)定為4℃,二極管陣列檢測器(FINNIGANSURVEYORPDAPlus)的檢測波長為350~750nm。采用電噴霧電離源(ESI)正離子電離模式,噴霧電壓2.5kV,鞘氣流量25L/min,輔助氣流量5L/min,離子傳輸毛細管溫度320℃,噴霧器溫度300℃。掃描采用SRM模式。特征碎片離子及碰撞能量見表1。采集時間均為0.2s,碰撞氣體采用高純氬氣,碰撞氣壓力0.2Pa。Q1和Q3分辨率均設(shè)定為半峰寬0.7Da。2結(jié)果與討論2.1srm-過濾法以流動注射方式對1ng/L的5種色素標準溶液進行ESI-MS分析,分別在正、負離子模式下檢測。對比兩種模式,各目標物的正離子信號比負離子信號強度高1~3個數(shù)量級,因此選擇正離子模式作為質(zhì)譜采集模式。在正離子模式下離子峰的信號最強,葉綠素a、葉綠素b和巖藻黃素產(chǎn)生的[M+H]+分別為m/z893.6、907.6和m/z659.3;β,β-胡蘿卜素和葉黃素產(chǎn)生的[M]+分別為m/z536.3和m/z568.4。故選擇各目標化合物的[M+H]+或[M]+作為SRM模式的母離子進行二級質(zhì)譜掃描,葉綠素a的母離子在二級質(zhì)譜中脫去二十碳烯鏈形成[M+H-C20H40]+離子峰,再脫去一個乙酸形成[M+H-C20H40-CH3COOH]+離子峰,其二級碎裂如圖1a所示,主要產(chǎn)生碎片離子m/z615.3和m/z555.2。葉綠素b在二級質(zhì)譜中的裂解規(guī)律與葉綠素a相同(因為兩者在結(jié)構(gòu)上差異小,葉綠素b的側(cè)鏈上為-CHO,葉綠素a為-CH3),其二級碎裂如圖1b所示,主要產(chǎn)生碎片離子m/z628.8和m/z569.3。β,β-胡蘿卜素的母離子在二級質(zhì)譜中脫去一個甲苯形成[M-C7H8]+離子峰,再脫去一個甲基形成[M-C7H8-CH3]+離子峰,其二級碎裂如圖1c,主要產(chǎn)生碎片離子m/z444.3和m/z429.1。葉黃素的母離子在二級質(zhì)譜中脫去一個甲苯形成[M-C7H8]+離子峰,再脫去一個β-環(huán)形成[M-C7H8-C9H13O]+離子峰,其二級碎裂如圖1d,主要產(chǎn)生碎片離子m/z476.3和m/z338.1。巖藻黃素的母離子在二級質(zhì)譜中脫去一分子水形成[M+H-H2O]+離子峰,再脫去一分子水和一個乙酸形成[M+H-2H2O-CH3COOH]+離子峰,其二級碎裂如圖1e,主要產(chǎn)生碎片離子m/z641.1和m/z567.1。選擇上述母離子和主要碎片離子作為定量離子,以SRM正離子模式優(yōu)化錐孔電壓(tubelensoffset)、碰撞能量(collisionenergy)等質(zhì)譜參數(shù)。5種色素標準溶液的SRM離子流圖如圖2所示。2.2方法驗證2.2.1標準曲線、檢出限和定量限用標準儲備液分別精確配制含葉綠素a、葉綠素b、β,β-胡蘿卜素和葉黃素為10、50、100、500和1000μg/L,巖藻黃素為100、150、200、500和1000μg/L的混合標準溶液。采用1.5節(jié)的條件進行HPLC-MS分析。結(jié)果顯示5種色素標準品在其線性范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)r2>0.996,其標準曲線如表2所示。各取10μL1μg/L葉綠素a、1μg/L葉綠素b、1μg/Lβ,β-胡蘿卜素、1μg/L葉黃素和10μg/L巖藻黃素標準溶液進行分析,測定此濃度下的信噪比(S/N)。將對應(yīng)S/N=10和S/N=3的各標準溶液濃度分別作為定量限(LOQ)和檢出限(LOD),結(jié)果如表2所示。方法的LOD均不高于0.16μg/L,LOQ在0.06~0.54μg/L之間。而HPLC方法的檢出限和定量限分別在1.05~12.70μg/L和3.14~38.11μg/L之間,表明本方法檢測色素的靈敏度很高。2.2.2方法的精密度實驗取低、中、高3個濃度的混合標準溶液進行測定,計算方法的精密度。在一天內(nèi)連續(xù)進樣測定5次,記錄5種色素的峰面積及保留時間,分別計算各色素的保留時間和峰面積的精密度,各色素的保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD)見表3。由此可見,保留時間的日內(nèi)RSD為0.07%~0.41%,峰面積的日內(nèi)RSD為0.42%~4.20%;連續(xù)5天每天連續(xù)進樣測定5次,記錄5種色素的峰面積及保留時間,分別計算各色素的保留時間和峰面積的日間精密度,各色素保留時間和峰面積的日間RSD見表3。由此可見,保留時間的日間RSD為0.04%~0.40%,峰面積的日間RSD為0.57%~4.30%。實驗結(jié)果表明本方法的精密度良好。通過空白添加實驗方法測定方法的回收率。以空白濾膜為樣品,分別添加低、中、高3個水平的標準溶液進行加標回收實驗,每個加標水平平行測定3次,結(jié)果見表3。由此可見5種色素的加標回收率均在82%以上,RSD低于8%。該方法較好地滿足了藻類樣品中色素含量的測定要求。2.3藻種的檢測結(jié)果藻種收獲時先用顯微鏡進行細胞計數(shù),分別取100mL赤潮異彎藻(NMBRah03-2)、赤潮異彎藻(NMBRah03-2-2)、卡羅藻(NMBjah047-1)、微小原甲藻(NMBjah042)、微擬球藻(NMBluh014)、蛋白核小球藻(NMBluh015-1)、顆石藻(NMBjih026-1)、定鞭金藻(NMBjih029)、中肋骨條藻(NMBguh004-1)、威氏海鏈藻(NMBguh021)和假微型海鏈藻(NMBguh005),測定藻的密度分別為2.75×105、8.25×104、7.75×104、8.25×104、1.75×105、6.76×104、2.00×105、7.25×105、2.18×106、3.95×104和1.40×106cell/mL。然后按照所建立的方法對每個藻種進行處理,每個樣品平行上機檢測3次。線性方程計算結(jié)果顯示:葉綠素a和β,β-胡蘿卜素存在于所有檢測的藻種中,其中葉綠素a含量在顆石藻(NMBjih026-1)中最高(6.19×10-3ng/cell),在赤潮異彎藻(NMBRah03-2-2)中最低(4.42×10-5ng/cell);β,β-胡蘿卜素含量在赤潮異彎藻(NMBRah03-2-2)中最高(6.65×10-4ng/cell),在微擬球藻(NMBluh014)中最低(1.75×10-5ng/cell);葉綠素b僅在微擬球藻(NMBluh014)和蛋白核小球藻(NMBluh015-1)中檢測到,含量分別為1.46×10-5和7.85×10-6ng/cell;葉黃素僅在微擬球藻(NMBluh014)和蛋白核小球藻(NMBluh015-1)中檢測到,含量分別為1.53×10-6和1.21×10-6ng/cell;巖藻黃素在赤潮異彎藻(NMBRah03-2)