2023基因編輯原理治療路徑及全球研發(fā)進展報告

2023年深度行業(yè)分析研究報告2 基因編輯帶來希望 科學(xué)原理：認(rèn)識DNA——DNA缺陷伴隨一生且可能影響后代 7什么是DNA？ DNA如何影響我們？ DNA與基因疾病和遺傳性疾病 工程原理：基因編輯——精準(zhǔn)定位、永久修正 9精確定位是基因編輯的核心 基因編輯VS.基因治療：基因編輯具有永久有效的潛力 基因編輯帶領(lǐng)生物藥物進入新階段 TALEN CRISPR 基因編輯治療路徑：體內(nèi)VS.體外 結(jié)構(gòu)與機理 永久糾正致病基因 精確靶向致病源頭 LNP遞送已得到驗證 安全風(fēng)險仍是重中之重，風(fēng)險獲益比是適應(yīng)癥選擇的關(guān)鍵 20 設(shè)計和技術(shù)原理 21DNA修復(fù)機制不確定性較高 24 26人體免疫屏障可能降低AAV遞送效率 26體內(nèi)基因編輯 體外基因編輯 體外基因編輯助力細(xì)胞治療 28多種人體免疫機制限制細(xì)胞治療 28基因編輯改造細(xì)胞，盡量避免不需要的免疫機制 29基因編輯改造細(xì)胞，加強對腫瘤細(xì)胞的殺傷力 303尋找合適的策略和編輯位點，考驗研發(fā)機構(gòu)對細(xì)胞機制的理解水平 31體外基因編輯特點 32 案例1：NTLA-2001——體內(nèi)基因編輯-基因敲除 33案例2：NTLA-2002——體內(nèi)基因編輯-基因敲除 40案例3：NTLA-3001——體內(nèi)基因編輯-基因敲入 44案例4：EXA-CEL（CTX-001）——體外基因編輯 46研發(fā)管線特點 534 7 8 10 11 12 13 14 16 17 18 20 21 22 23 25 26 28 29 29 30 30 31 31 32 33 34 35 35 36 365 37 38 39 39 40 41 41 42 43 43 45 45 46 46 47 47 48 48 49 50 51 52 52 53 54 54 55 556前言基因編輯帶來希望基因是決定生物表征的重要因素。一般將基因?qū)挿豪斫鉃榇鎯ι镞z傳信息的載體。基因的存在使生物能夠保留優(yōu)勢表征，是高級生物出現(xiàn)的基礎(chǔ)。但是基因的遺傳也伴隨著大量的不確定性，不確定性來自于生物活動的隨機性，不確定性帶來了進化的可能性，同時也帶來了疾病風(fēng)險。對于大部分有性繁殖生物來說，基因一半來自父親一半來自母親，因此后代可能因為基因的純合或雜合導(dǎo)致父輩中未曾出現(xiàn)過的疾病。在人類以往的歷史中，基因疾病往往難以治愈。由于基因深藏于人類身體最深處，難以從源頭解決問題，通常需要長期服藥以控制疾病進展，疾病負(fù)擔(dān)較重。同時，許多基因疾病屬于罕見病，治療方案十分有限，導(dǎo)致較高的藥物價格和較低的可及性，屬于未被滿足的醫(yī)療需求。隨著基因編輯工具的不斷進步，基因編輯療法也進入了發(fā)展的快車道。TALEN、ZFN，以及幾乎革新了整個基因編輯領(lǐng)域的CRISPR-Cas系統(tǒng)使基因編輯療法變得觸手可及。2020年，來自加州大學(xué)伯克利分校的JenniferDoudna教授和普朗克研究所的EmmanuelleCharpentier因在CRISPR領(lǐng)域的突出貢獻獲得了諾貝爾化學(xué)獎。與此同時，J.Doudna教授作為共同創(chuàng)始人成立的IntelliaTherapeutics，E.Charpentier作為共同創(chuàng)始人成立的CRISPRTherapeutics已成長為基因編輯治療領(lǐng)域的領(lǐng)軍者，兩家公司均已有管線進入臨床階段，有望在不久的未來，為困擾人類已久的基因疾病治療帶來曙光。同時，基于基因編輯技術(shù)，方興未艾的細(xì)胞治療也有望迎來跨越式的發(fā)展。7科學(xué)原理：認(rèn)識DNA——DNA缺陷伴隨一生且可能影響后代了解基因疾病、遺傳疾病前，首先需要了解致病機理發(fā)生的物質(zhì)——DNA。脫氧核糖核酸（DNA）是人類存儲遺傳信息的物質(zhì)。DNA通常由2條DNA鏈形成互相纏繞的雙螺旋結(jié)構(gòu)。DNA的基本組成單位是4種核苷酸：腺嘌呤（Adenine，A）、胸腺嘧啶（Thymine，T）、胞嘧啶（Cytosine，C）、鳥嘌呤（Guanine，G）。每個核苷酸由3部分組成：磷酸基、五碳糖、堿基。4種核苷酸的堿基不同。單個DNA鏈之間的核苷酸由五碳糖和磷酸基之間的共價鍵相連，2個鏈條間則由堿基之間的氫鍵相互吸引，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。2個堿基通過氫鍵相連的現(xiàn)象被稱為堿基配對。堿基配對（basepairing）中A與T配對，C與G配對。圖表1：4種核苷酸結(jié)構(gòu)及堿基配對資料來源：NIHNationalHumanGenomeResearchInstitute，中銀證券DNA通過蛋白控制影響著身體的活動和表征。DNA轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的過程分為兩大步，第一步：DNA轉(zhuǎn)化為mRNA，這一步驟稱為轉(zhuǎn)錄（transcription），發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)；第二步：mRNA轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，這一步驟稱為轉(zhuǎn)譯（translation），發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。mRNA是DNA轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的中間體，這也是它名稱的由來，即信使RNA（messengerRNA）。通俗來講，DNA類似于底稿，DNA發(fā)生的改變會一直存在于體內(nèi)，由此細(xì)胞分裂新產(chǎn)生的細(xì)胞也會繼承這些改變，因此DNA的改變有很大概率會伴隨一生，其中性細(xì)胞中DNA的變化甚至能夠遺傳至下一代。同時部分DNA片段會影響mRNA產(chǎn)生的速率與表達量。mRNA類似于說明書，能夠指導(dǎo)自身細(xì)胞生產(chǎn)出特定的蛋白。蛋白則是最終生產(chǎn)得到的工具，對生物個體的各項指標(biāo)直接產(chǎn)生作用。mRNA或蛋白的變化不會被繼承或遺傳。這一條轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯鏈被稱為生物學(xué)“中心法則”（TheCentralDogma）。8圖表2：中心法則：DNA-mRNA-蛋白轉(zhuǎn)化過程資料來源：T.Winslow,“TranscriptionandTranslation”,Nat根據(jù)美國國家癌癥研究院的定義，遺傳性疾?。╤ereditarysyndrome）通常指部分或完全由具有遺傳性的基因或染色體異常導(dǎo)致的疾病。根據(jù)美國國家人類基因研究院的定義，基因疾?。╣eneticdisorder）指完全或部分由于DNA序列異常導(dǎo)致的疾病。遺傳性疾病和基因疾病雖然不完全相同，但包含了很多重疊的病癥。DNA作為人類遺傳物質(zhì)的存儲載體，深藏在細(xì)胞核中。一方面受到細(xì)胞結(jié)構(gòu)和人體免疫機制的層層保護，不易發(fā)生改變；但另一方面，在出現(xiàn)基因異常時，現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)技術(shù)也難以提供有效的治療方案。同時，DNA異常通常會伴隨患者一生，且有很大幾率遺傳至后代。因此，患者疾病負(fù)擔(dān)大，且缺乏有效的治療手段。除此之外，許多罕見病是由基因缺陷造成的。大部分具有缺陷的基因，會導(dǎo)致基因的攜帶者難以生存。由于基因是遺傳信息載體，因此在長時間的自然選擇中，這類基因難以被繼承，所以許多基因疾病/遺傳疾病都屬于未被滿足的醫(yī)療需求。9工程原理：基因編輯——精準(zhǔn)定位、永久修正精確定位是基因編輯的核心基因編輯工具使人類擁有了定向改變DNA或RNA的能力。通過插入、刪除、替代特定位點的核苷酸，我們能夠改變基因表達，進而長久地影響蛋白序列或結(jié)構(gòu)。援引發(fā)表在YaleJournalofBiologyandMedicine上的文章“GenomeEditing:Past,Present,andFuture”的內(nèi)容，歷史上，人類不斷探索能夠改變基因的方式。在20世紀(jì)時，人類曾通過化學(xué)療法、放射療法改變腫瘤細(xì)胞的DNA，擾亂腫瘤細(xì)胞的生命活動，以此消滅腫瘤。但這2種方法造成的基因變化是隨機的，且難以精準(zhǔn)定位。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)明了3種重要的基因編輯工具：鋅指（ZFN）、TALEN、CRISPR?，F(xiàn)代基因編輯工具的出現(xiàn)不僅大大加速了科學(xué)研究，同時也給許多基因疾病的治療帶來的可能性。精準(zhǔn)定位是基因編輯的重要能力，是實現(xiàn)定向編輯的第一步。靶向特定目標(biāo)序列，而不是在DNA任意位置隨意更改，使基因編輯成為可控的工具，并且規(guī)避不受控的基因突變帶來的風(fēng)險。不受控制的基因突變或不夠精準(zhǔn)的基因修改，常常會帶來無法預(yù)測的腫瘤、免疫疾病等惡性病癥。在精確定位的基礎(chǔ)上，一個好的基因編輯工具還應(yīng)該能夠識別并定位到任意的設(shè)定序列。這樣基因編輯才能夠廣泛應(yīng)用于不同的基因疾病。許多基因疾病是由DNA的錯誤表達或過度表達引起的。通過基因敲除或抑制，便能達到較好的治療效果。因此，僅僅依靠基因編輯工具進行定位，同時引入可控的酶在這一位點進行切割，便能大大緩解乃至治愈這類疾病。目前，大部分體內(nèi)基因編輯療法便是利用這一機理，對致病基因進行定隨著生物技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們已經(jīng)開始了基因敲入的研發(fā)。相較于基因敲除，基因敲入更為復(fù)雜，往往需要基因編輯工具以及基因插入技術(shù)（例如病毒載體插入技術(shù)）共同完成，因此目前的進展落后于基因敲除療法。但基因敲入帶來了更多治愈疾病的可能性，尤其對于部分由基因過少或缺失表達引起的疾病。雖然名稱相似，但基因編輯（geneediting）與基因治療（genetherapy）有著本質(zhì)的不同。基因編輯，通過對基因進行改造，糾正錯誤的基因。由于這一改變發(fā)生在原本的基因組中，因此，就算細(xì)胞發(fā)生了分裂，這一改變也會被繼承。因此，基因編輯通常被認(rèn)為具有永久糾正致病基因的潛力。更進一步，若這一改變發(fā)生在性細(xì)胞中，則這一改變將可能被后代繼承?；蛑委?，則是通過遞送額外的基因進入細(xì)胞，使得細(xì)胞能夠額外表達上述基因，但并不改變此前已經(jīng)存在的基因。新的基因也不會被整合進入原本的基因組中，因此，在細(xì)胞發(fā)生分裂后，這一改變也不會被繼承。理論上來講，相較于基因編輯，基因治療的持久性稍差。圖表3：基因治療vs.基因編輯治療資料來源：GeneticEngineering&BiotechnologyNews，中銀證券基因編輯帶領(lǐng)生物藥物進入新階段人類對生物醫(yī)藥的探索不斷，所掌握的藥物種類不斷豐富。從小分子化學(xué)藥到生物藥、核酸干擾藥物（RNAi）、基因治療、基因編輯治療。隨著藥物種類的豐富，治療能夠觸達的靶點也更為廣闊：小分子化學(xué)藥和生物藥（單抗、雙抗等）作用于蛋白質(zhì)，RNAi作用于RNA，基因治療和基因編輯則作用于DNA。圖表4：藥物迭代史資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券TALEN，TranscriptionActivation-LikeEffectorNucleases，是一種限制性酶。通過工程化改造后，具有切割DNA鏈特定位點的能力。TALEN主要分為2個功能域：DNA結(jié)合域（DNAbindingdomain）和DNA切割域（DNAcleavagedomain）。DNA結(jié)合域負(fù)責(zé)識別位點，引導(dǎo)切割酶至正確的編輯位點。DNA結(jié)合域的核心部分由相連的數(shù)個重復(fù)的氨基酸序列片段組（tandemaminoacidrepeats）組成，每個氨基酸片段組由33-34個單位的氨基酸構(gòu)成，每個片段組對應(yīng)DNA鏈上的1個堿基。每個氨基酸片段組的序列基本相同，除了第12-13個氨基酸不同，這兩個位點被稱為repeat-variablediresidue（RVD）。正因為這2個位置的氨基酸可變，因此通過控制這兩個位置的氨基酸，基因編輯工具可以靶向DNA的4種不同堿基。每個片段組對應(yīng)1個DNA堿基，數(shù)個前后銜接的片段組便可以靶向特定的DNA序列。圖表5：TALEffector結(jié)構(gòu)資料來源：Science，中銀證券圖表6：TALEffector中一個repeat單位的蛋白三維結(jié)構(gòu)示意圖資料來源：Nature，中銀證券注：一個TALEffector包含多個repeats，圖中結(jié)構(gòu)為1個repeat的蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。這些repeats幾乎相同，除第12、13位點（以紅色標(biāo)示）不甚相同。這兩個位點被稱為RVD，不同的RVD與DNA不同的堿基親和。RVD是TALEN可以工程化識別不同DNA序列的核心。圖表7：TALEffector與DNA結(jié)合后的三維結(jié)構(gòu)示意圖資料來源：Science，中銀證券注：1個TALEffector中包含數(shù)個repeats，每個repeat（以不同顏色區(qū)分）對應(yīng)DNA鏈（中心的灰色雙螺旋結(jié)構(gòu)）上的1個單位堿基。左圖為垂直于DNA鏈視角的正視圖，右圖為沿DNA鏈延伸方向的視角圖。DNA切割域在DNA結(jié)合域的幫助下，來到選定的位點進行切割。FokI內(nèi)切酶是常見的切割工具。FokI需要形成二倍體（dimer）來進行切割，因此TALEN通常由2條分別靶向DNA正鏈和反鏈的TALEN組成。TALEN將會切割2個靶向序列之間的位置。圖表8：TALEffector+FokI二倍體資料來源：ActaNaturae，NIH，中銀證券優(yōu)勢相較于ZFN，TALEN靶向性更強，毒性較?。赡苡捎诟鼫?zhǔn)確的親和導(dǎo)致）。相較于ZFN，TALEN不需要選擇或定向進化，節(jié)省構(gòu)造時間和成本。相較于CRISPR，TALEN不需要PAM序列，理論上可選擇的靶點更多。（但由于基因組中通常有多個潛在有效靶點，因此這一優(yōu)勢并不突出）劣勢TALEN結(jié)構(gòu)較大，對遞送提出了較高的要求。常見的病毒載體慢病毒（lentivirus）和腺相關(guān)病毒（AAV）難以運送這么大分子量的“貨物”。目前科學(xué)家嘗試以mRNA的方式遞送TALEN。相較于CRISPR，TALEN的制造流程相對復(fù)雜，成本較高。相較于CRISPR，TALEN的結(jié)構(gòu)設(shè)計更為復(fù)雜。CRISPR僅需重新構(gòu)建gRNA序列即可，而TALEN需要考慮DNA結(jié)合等因素。CRISPR，ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat，來源于細(xì)菌和其他微生物。CRISPR是細(xì)菌對抗病毒入侵的重要免疫機制，通過識別病毒基因序列，CRISPR可以引導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)的生物機制對病毒基因序列進行摧毀和消滅，使病毒無法在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制繁殖。CRISPR是細(xì)菌基因組內(nèi)的一片由短小DNA重復(fù)片段（回文）和spacer組成的區(qū)域。當(dāng)某一種類病毒首次入侵時，病毒的部分基因片段會被整合存儲在spacer中。經(jīng)過轉(zhuǎn)錄（transcription）和各類蛋白的處理，帶有病毒基因序列的CRISPRRNA（crRNA）形成，并引導(dǎo)分子切割機制對病毒基因進行切割。由于序列直接由病毒基因復(fù)制得到，因此crRNA與病毒基因的識別匹配程度非常高。圖表9：CRISPR對抗病毒入侵機制資料來源：SITNHMSHarvardUniversity，中銀證券圖表10：CRISPR結(jié)構(gòu)資料來源：NewEnglandBiolabs，中銀證券CRISPR機制賦予了一個可靠的定位機制。在此基礎(chǔ)上，一個完整的基因編輯工具還需要切割機制來對DNA鏈進行切割。自然界中，細(xì)菌的CRISPR免疫系統(tǒng)中包含的Cas家族基因（CRISPR-associatedgene）便可以完成這一工作。Cas家族中包含多個不同的基因，擁有不同的功能或切割方式。圖表11：CRISPR-Cas系統(tǒng)可選擇不同的切割酶資料來源：NewEnglandBiolabs，中銀證券gRNA負(fù)責(zé)是CRISPR基因編輯的定位器。gRNA由crRNA和tracrRNA組成。crRNA攜帶有目標(biāo)序列的RNA。crRNA和tracrRNA形成互補結(jié)構(gòu)，科學(xué)家進一步研究發(fā)現(xiàn)，將crRNA和tracrRNA相連，并不影響整體機制的運作和活性。形成的單鏈gRNA（sgRNA）更為便捷。Cas蛋白是負(fù)責(zé)切割DNA鏈的剪刀。Cas蛋白中，HNH域負(fù)責(zé)切割靶序列，RuvC域負(fù)責(zé)切割靶序列的互補鏈。切割位點與PAM序列相關(guān)。此前CRISPR無法在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮作用，原因是CRISPR-Cas系統(tǒng)無法穿過核膜進入細(xì)胞核。張鋒團隊在Cas蛋白序列上添加了NLS（NuclearlocalizationsequenceNLS與入核載體相互作用，將Cas運載進入細(xì)胞核。優(yōu)勢易于操作，簡單便捷。設(shè)計空間大，基本可以靶向任何靶點序列。成本較低。gRNA和Cas可以拆分遞送。劣勢CRISPR的gRNA長度有限制，可能導(dǎo)致脫靶事件出現(xiàn)?；蚓庉嬛委熉窂剑后w內(nèi)VS.體外基因編輯治療根據(jù)基因編輯發(fā)生的場景主要分為2條路徑：體內(nèi)（invivo）和體外（exvivo）。圖表12：基因編輯治療的2條路徑資料來源：CRISPRTherapeutics，中銀證券體內(nèi)基因編輯指將基因編輯工具遞送進入患者體內(nèi)，基因編輯發(fā)生在人體內(nèi)。而顧名思義，體外基因編輯治療中，基因編輯發(fā)生在體外（例如實驗室等通常需要提取患者細(xì)胞，在實驗室中對患者細(xì)胞進行基因編輯，再將經(jīng)工程化改造后的細(xì)胞回輸至患者體內(nèi)。整體流程類似于現(xiàn)有的CAR-T細(xì)胞治療。兩條路徑各有優(yōu)勢，也各有不同的技術(shù)挑戰(zhàn)。目前來看，采用體外基因編輯路徑的公司相對更多。這一選擇可能是由于體內(nèi)基因編輯對安全性的要求更高、技術(shù)難度更大。體內(nèi)基因編輯-基因敲除體內(nèi)基因編輯是指將基因編輯工具遞送進入人體，在人體中對致病基因進行編輯處理的治療方式。從編輯方式來看，可分為敲除（knock-out）和敲入（knock-in）兩種模式，也可同時進行敲除和敲入。敲除，顧名思義，即是將某些錯誤表達或過度表達的基因進行抑制，使得患者身體不再繼續(xù)生產(chǎn)錯誤的蛋白。相反，敲入則是將患者缺失的基因遞送進入體內(nèi)，使患者能夠正常生產(chǎn)之前缺失的蛋白。相較于敲除，敲入的技術(shù)難度較高，目前進度也相對滯后。從技術(shù)角度來說，敲入包含了敲除所需的所有技術(shù)步驟，同時還需要額外的插入技術(shù)。因此，本章節(jié)中將主要介紹敲除，在下一章節(jié)簡單介紹敲入。圖表13：基因編輯治療的2條主要路徑資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券目前這一路徑的領(lǐng)導(dǎo)者是諾貝爾獎得主、UCBerkeley教授JenniferDoudna作為共同創(chuàng)始人的IntelliaTherapeutics。以Intellia的管線之一NTLA-2002為例，以此窺探體內(nèi)基因編輯療法的大概原理。NTLA-2002的有效成分由脂質(zhì)微粒（lipidnanoparticle，LNP）包裹，以內(nèi)含體（endosome）的形式進入細(xì)胞。藥物有效成分主要由2種分子組成：靶向目標(biāo)基因序列（此處NTLA-2002中，即KLKB1基因）的guideRNA（gRNA），以及編碼Cas9的mRNA。Cas9mRNA在進入細(xì)胞質(zhì)后被核糖體翻譯為Cas9蛋白。Cas9蛋白與gRNA形成結(jié)合體，并進入細(xì)胞核。gRNA將結(jié)合體引導(dǎo)至設(shè)定的基因序列，Cas9對其進行切割。由此，致病基因不再能夠產(chǎn)生致病蛋白。圖表14：體內(nèi)基因編輯治療原理資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券由于體內(nèi)基因編輯直接作用于人體DNA，因此其對基因的糾偏將被存儲于人體的遺傳信息中。細(xì)胞分裂后的子細(xì)胞將會繼承編輯后的DNA。因此，通過一次高效的基因編輯，致病基因有望永久被糾正。這一特征已在Intellia的兩個產(chǎn)品管線中體現(xiàn)。NTLA-2001，用于治療由轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（ATTR）造成的神經(jīng)疾病和心肌疾病，只需1次給藥，便可使蛋白淀粉樣沉淀長時間維持較低reduction”）。另一管線，NTLA-2002，用于治療遺傳性血管水腫（HAE），同樣也只需1次給藥，從目前的臨床研究患者跟蹤來看，藥效明顯且持續(xù)。由于1次給藥即可發(fā)揮持久的藥效，基因編輯療法無需冗長繁瑣的療程，有望明顯提高患者的依從性。由于CRISPR對基因序列的識別具有較高的精度，因此體內(nèi)基因編輯治療能夠精確靶向致病基因，而不影響人體其他機制的正常工作。體內(nèi)基因編輯療法的主要作用成份是2種RNA，因此需要進入細(xì)胞后才可發(fā)揮作用。目前針對RNA疫苗及藥物，最主要的遞送系統(tǒng)之一便是脂質(zhì)納米微粒（LNP）。LNP遞送系統(tǒng)在本次新冠mRNA疫苗中已獲得了較為充分的驗證。LNP由4種主要成分構(gòu)成：可陽離子化脂質(zhì)（cationicionizablelipid）、中性脂質(zhì)、膽固醇、PEG。圖表15：LNP結(jié)構(gòu)資料來源：Pharmaceuticals，MDPI，中銀證券其中，可陽離子化脂質(zhì)是核心成分，它深刻影響著RNA遞送進入細(xì)胞后的釋放。在進入細(xì)胞前，可陽離子化脂質(zhì)在常規(guī)的生理環(huán)境下呈中性。包裹RNA藥物成分的LNP抵達細(xì)胞后，以內(nèi)含體（endosome）的形式進入細(xì)胞。由于內(nèi)含體內(nèi)部環(huán)境逐漸酸性化（endosomalacidification），可陽離子化脂質(zhì)質(zhì)子化（protonate），與中性脂質(zhì)互相作用，破壞原本LNP以及內(nèi)含體的結(jié)構(gòu)，使得RNA能夠逃離，進入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。因此，一個優(yōu)秀的可陽離子化脂質(zhì)以及LNP結(jié)構(gòu)能夠在藥物進入細(xì)胞前穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)，保護運載的RNA；在進入細(xì)胞后，又能夠充分打開包裹，使得RNA能夠充分地釋放到細(xì)胞質(zhì)中，以實現(xiàn)較好的藥效。20圖表16：LNP結(jié)構(gòu)及釋放資料來源：Nature，中銀證券LNP能夠遞送較大分子量的藥物成分進入細(xì)胞。因此，能夠較好地包裹gRNA和Cas9mRNA。LNP具有生物降解性。因其主要構(gòu)成成分為脂質(zhì)，可通過人體正常的代謝活動降解，對人體造成的負(fù)擔(dān)有限。LNP安全性較好。相對于其他遞送系統(tǒng)，例如病毒載體，其本身的免疫原性較低，因此不易引起免疫系統(tǒng)過度反應(yīng)。LNP規(guī)?；a(chǎn)相對簡單，放大生產(chǎn)難度低，同時已有mRNA疫苗大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)經(jīng)驗。LNP可通過外層結(jié)構(gòu)設(shè)計，來靶向特定的器官或細(xì)胞種類。除技術(shù)方面外，使用LNP目前面臨的一大挑戰(zhàn)是專利問題。目前最常見的規(guī)避專利的方法是自主設(shè)計可陽離子化脂質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。這對研發(fā)團隊在生物化學(xué)及分子生物學(xué)的素養(yǎng)提出了較高的要求。由于CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的底層運作必須經(jīng)過雙鏈斷裂（DSB，double-strandbreaking），而DSB對于基因而言是一個較大的變動，其本身可控性較差，難以預(yù)測可能造成的結(jié)果，帶來了腫瘤、免疫疾病的風(fēng)險。相較于體外基因編輯可以通過質(zhì)量控制來掌控進入人體的編輯產(chǎn)物，體內(nèi)基因編輯無法進行類似的質(zhì)量控制，因為體內(nèi)基因編輯是將編輯工具送入人體內(nèi)，在人體中完成編輯工作，因此，若出現(xiàn)脫靶事件，錯誤編輯的細(xì)胞仍會留在體內(nèi)。因此，相較于體外基因編輯，體內(nèi)基因編輯的安全風(fēng)險更大，這也將是這類療法面臨監(jiān)管審批時最大的挑戰(zhàn)。因此，適應(yīng)癥的選擇非常重要。在安全性未確定的情況下，未被滿足的醫(yī)療需求，尤其是目前尚未有有效療法，生存期較短和生存概率低的病癥，可能是體內(nèi)基因編輯治療較好的選擇。21體內(nèi)基因編輯-基因敲入如上文所述，體內(nèi)基因編輯相較于體外基因編輯難度更高，而體內(nèi)基因編輯中，基因敲入比基因敲除難度更高。因此，基因敲入所需掌握的技術(shù)復(fù)雜，要求高。因此目前進展也落后于其他路徑。從步驟上來看，基因敲除通過CRISPR系統(tǒng)gRNA和Cas在特定位點剪切DNA鏈，造成雙鏈斷裂（DSB），使靶點基因無法正常表達。根據(jù)Intellia的設(shè)計思路，基因敲入同樣需要CRISPR系統(tǒng)先剪切DNA雙鏈，再通過病毒載體（Intellia目前使用的是腺相關(guān)病毒AAV作為載體）在剪切位置插入缺失的基因。因此基因敲入由2個部分組成。第一部分由LNP作為遞送系統(tǒng)包裹用于定位的gRNA和編碼Cas（用于切割）的mRNA，在設(shè)定位點進行切割。第二部分由病毒載體作為遞送系統(tǒng)，將患者缺失的基因遞送進入細(xì)胞核，并整合進患者基因中。圖表17：體內(nèi)基因編輯-敲入治療實現(xiàn)路徑資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券AAV可將希望遞送的基因片段包裹進病毒載體顆粒。病毒載體經(jīng)細(xì)胞表面的受體識別，由內(nèi)含體（endosome）包裹進入細(xì)胞內(nèi)。進入細(xì)胞后，部分病毒顆粒從內(nèi)含體逃逸至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，部分病毒顆粒則跟隨內(nèi)含體到達溶酶體（lysosome）后再逃逸進入細(xì)胞質(zhì)。隨后，病毒顆粒進入細(xì)胞核，并褪去外殼，將攜帶的基因釋放出來。圖表18：AAV基因遞送原理22資料來源：Nature，中銀證券原文注：DiagramofrAAVtransductionpathway.Adeno-associatedvirus(AAV)isrecognizedbyglycoofthehost.Thistriggersinternalizationofthevirusviaclathrin-mediatedendocytosis.AAVthentrafficsthroughthecytosolmediatedbythecytoskeletalnetwork.OwingtothesomewhatlowpHenvironmentoftheendosome,theVP1/VP2regionundergoesaconformationalchange.Followingendosomalescape,AAVundergoestransportintothenucleusanduncoating.AAVcanalsoundergoproteolysisbytheproteasome.TherearecurrentlytwoclassesofrecombinantAAVs(rAAVs)inuse:single-strandedAAV(ssAAV)andself-complementaryAAV(scAAV).ssAAVsarepackagedaseithersense(plus-stranded)orantgenomes.Thesesingle-strandedformsarestilltranscriptionallyinertwhentheyreachthenucleusandmustbeconvertedtodouble-strandedDNAasaprerequisitefortranscription.ThisconversioncanbeachievedbysecondstrandsynthesisviahostcellDNApolymerasesorbystrandannealingoftheplusandminusstrandsthatmaycoexistinthenucleus.BecausescAAVsarealreadydouble-strandedbydesign,theycanimmediatelyundergotranscription.Theviralinvertedterminalregenomecandriveinter-molecularorintra-molecularrecombinationtoformcircularizedepisomalgenomesthatcanpersistinthenucleus.Vectorgenomescanalsoundergointegrationintothehostgenomeatverylowfrequencie在上一步中，gRNA和Cas蛋白已在DNA上的特定位點進行了剪切。細(xì)胞的修復(fù)機制會試圖將斷裂的DNA重新連接在一起。常見的修復(fù)機制有兩種，HDR（homology-directedrepair，同源介導(dǎo)修復(fù)）和NHEJ（non-homologousend-joining，非同源末端接合）。實現(xiàn)基因敲入需要HDR修復(fù)，而NHEJ無法幫助實現(xiàn)基因敲入。HDR：是最為重要且常見的修復(fù)方式，同時也是實現(xiàn)基因敲入所需要的修復(fù)方式。HDR通過模版序列來修復(fù)斷裂的部分。模版序列可來自另一條姊妹染色體也可來自外部引入的DNA模版。模版序列的特征是擁有和斷裂DNA兩端相同的序列。HDR修復(fù)機制會根據(jù)模版序列將斷裂部分填補上，因此，若以姊妹染色體作為模版序列，斷裂的DNA將被恢復(fù)成原樣；若以外部引入的序列作為模版，修復(fù)后的DNA將包含模版中間的序列。因此，設(shè)計的序列將在兩端包含DNA斷裂兩側(cè)的序列，中間則是希望敲入的基因序列。在通過AAV將序列遞送進入細(xì)胞核后，便可作為模版序列供HDR對DNA進行修復(fù)，修復(fù)后的DNA便包含了希望敲入的基因。23NHEJ：作為最主要的DNA雙鏈斷裂的修復(fù)方式，本身具有較大的不確定性，在修復(fù)后常常會引入不同種類的突變（插入、刪除、替換），因此可能會產(chǎn)生框架漂移，導(dǎo)致錯誤的基因表達。由于基因突變通常會抑制基因的正常表達，因此NHEJ一般能夠在基因敲除中發(fā)揮作用。但在基因敲入方面，則不希望出現(xiàn)NHEJ，因為NHEJ重新連接斷裂DNA的序列是不確定的。圖表19：DNA雙鏈斷裂（DSB）后的2種修復(fù)方式：HDR和NHEJ資料來源：Bio-Rad，中銀證券HDR修復(fù)機制是合適的修復(fù)種類，因為HDR可能采用利用AAV病毒載體遞送進來的基因物質(zhì)作NHEJ是不合適的修復(fù)機制。因為NHEJ修復(fù)僅僅將斷裂的DNA連接起來，但如何連接是隨機的。NHEJ不僅不會按照AAV遞送的模板基因序列進行修復(fù)，還有可能引入其他突變。因此，如何使細(xì)胞盡可能多地采用HDR修復(fù)，是目前研究的關(guān)鍵點之一。24DNA雙鏈斷裂（DSB）的修復(fù)具有較高的不確定性。不確定性主要來自2方面：修復(fù)方式的選擇和修復(fù)方式本身的隨機性。首先，如上文所述，DNA雙鏈斷裂的修復(fù)機制主要是HDR和NHEJ。其中，只有HDR有可能實現(xiàn)基因敲入；NHEJ無法實現(xiàn)敲入，相反，NHEJ常常引入更多不確定的突變，例如：插入、刪減、替換，有可能造成框架漂移，引起腫瘤或其他疾病。因此，在CRISPR系統(tǒng)引入雙鏈斷裂后，希望人體盡可能多地使用HDR作為修復(fù)方式，并盡量減少NHEJ的發(fā)生。但是，細(xì)胞會選擇哪一種修復(fù)方式是不確定的，并且，修復(fù)方式的選擇受多種因素影響。在一項發(fā)表在Nature的研究中，來自Bio-Rad和UCSF的團隊試圖量化HDR和NHEJ發(fā)生的比例，并找到增加HDR、減少NHEJ的變量。研究發(fā)現(xiàn)，影響HDR和NHEJ發(fā)生比例的因素多種多樣，例如基因編輯工具的種類、Cas蛋白的選擇、gRNA的組合、方向、細(xì)胞種類、編輯位點等，都會對HDR和NHEJ的占比產(chǎn)生影響。因此，針對不同適應(yīng)癥、不同基因位點、不同細(xì)胞種類，基因敲入治療所需的gRNA、Cas蛋白、AAV序列等成分均需要新設(shè)計，同時進行排列組合，找出最佳搭配。在初始階段，這一過程需要大量的實驗驗證，研發(fā)時間長，因此，如果能夠成功，行業(yè)領(lǐng)軍者將獲得明顯的先發(fā)優(yōu)勢護城河。當(dāng)實驗數(shù)據(jù)的積累足夠充分后，后續(xù)的研發(fā)有望逐漸提速，因此，先發(fā)者的先發(fā)優(yōu)勢將有可能逐漸擴大。圖表20：HDR和NHEJ被用作修復(fù)方式的比例受多種因素影響25資料來源：Nature，中銀證券原文注：(a)ScatterplotsofdropletsshowingHDR-andNHEJ-inducingactivitiesofdualCas9-H840AandTALENatRBM20.Representative2DscatterplotsofdropletspositiveforNHEJ(blue)andWT(green)alleleswereobtainedfromHeLacellstransfectedwithdualCas9-H840AorTALENstargetingRBM20.BothsystemsfailedtoinduceHDR.(b)Quantifiedgenome-editingoutcomesatRBM20inHeLacells.HDR(red)andNHEJ(blue)allelicfrequency(%)isshown.(c)ScatterplotsofdropletsshowingHDR-andNHEJ-inducingactivitiesofCas9andTALENatRBM20.Representative2DscatterplotsofdropletspositiveforHDR(orange),NHEJ(blue),WT(green)alleleswereobtainedfromhumaniPSCstransfeinducedmoreHDRthanNHEJ(highlightedinbolditalic).(d)Quantifiedgenome-editingoutcomesatRBM20iniPSCs.HDR(red)andNHEJ(blue)allelicfrequency(%)isshown.ConditionsthatgaveequivalentormoreHDRthanNHEJarehighlightedinbolditalic.For(b,d),valuesaremean±SEM.(n=6).ThedifferencebetweenT-test(*p<0.05).S,sensestrandoligonucleotidedonor;AS,antisensestrandoligonucleotidedonor.TheassaysfromequivalentamountsofuneditedWTgenomicDNAweresubtractedfromeditedgenomicDNAs(SupplementaryFig.S6).Conditionswithlowactivityareshownin26不確定性還來自于HDR機制本身。雖然相較于NHEJ，HDR被認(rèn)為是較為精準(zhǔn)、不易出錯的修復(fù)方式，但仍有可能因為基因重組反應(yīng)（recombination）產(chǎn)生突變。綜合以上兩點，對于基因敲入至關(guān)重要的修復(fù)機制卻有不可忽視的不確定性，這對于最終基因編輯能否正確成功完成提出了挑戰(zhàn)。AAV，Adeno-associatedvirus，腺相關(guān)病毒，是一種單鏈DNA病毒。自然界中，AAV在許多脊椎動物中被發(fā)現(xiàn)，但目前普遍認(rèn)為AAV并不會引起人類疾病。AAV衣殼呈二十面體，直徑約26nm，AAV的基因組由正向或反向的單鏈DNA構(gòu)成，長度約4.7kb，這也基本決定了AAV被改造為遞送載體后它的載荷大致在這一水平。AAV基因組兩側(cè)分別有1個ITR（invertedterminalrepeat）作為側(cè)翼，ITR呈T形，在病毒復(fù)制與包封過程中起重要作用。AAV作為載體時，將編碼病毒蛋白的基因組去除，并用遞送的基因序列代替。AAV的載荷在4.7kb左右，這其中除希望表達的基因外，部分情況下還包含調(diào)節(jié)表達的序列，例如啟動子（promoter）。因此，AAV能夠遞送的基因材料相對有限。AAV遞送可能會受到多種、多層人體免疫系統(tǒng)的抵抗，導(dǎo)致遞送效率降低。中和抗體：感染自然腺相關(guān)病毒后產(chǎn)生的中和抗體在人體中循環(huán)。中和抗體能夠識別AAV類病毒的衣殼，因此不僅靶向自然AAV，也靶向重組AAV。目前，有研究團隊正在探索衣殼改造的方法，以規(guī)避免疫系統(tǒng)的檢驗，但目前還處于早期階段。除此之外，也有空衣殼誘餌、血漿去除等其他策略正在研究中。另外，病毒衣殼還有可能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CytotoxicTlymphocyte，CTL）免疫，AAV成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將可能受到攻擊，導(dǎo)致成功進行了基因編輯的細(xì)胞被殺死。雖然相較于其他病毒載體（例如腺病毒載體AAV誘導(dǎo)的CTL強度較低，但仍然影響整體遞送效率和基因編輯治療的有效性。圖表21：AAV遞送可能會受到多種人體免疫機制的抵抗資料來源：Nature，中銀證券27體內(nèi)基因編輯特點1：體內(nèi)基因編輯有望實現(xiàn)“一次給藥，永久治愈”。特點2：相較于體外，體內(nèi)基因編輯對技術(shù)的精準(zhǔn)性和可靠性要求更高，因為基因編輯發(fā)生在人體內(nèi)，所以無法通過質(zhì)量控制環(huán)節(jié)篩除編輯失敗的細(xì)胞。特點3：體內(nèi)基因編輯主要可分為基因敲除和基因敲入。其中基因敲入環(huán)節(jié)更多，需要掌握的技術(shù)特點4：基因敲除通常使用LNP遞送系統(tǒng)運輸CRISPR編輯工具進入體內(nèi)，基因敲入不僅需要LNP遞送編輯工具，還需要遞送修復(fù)模版（通常使用病毒載體AAV作為遞送系統(tǒng)）。特點5：這一細(xì)分市場，參與者較少。目前IntelliaTherapeutics擁有較明顯的領(lǐng)跑優(yōu)勢。28體外基因編輯體外基因編輯助力細(xì)胞治療相較于體內(nèi)編輯，體外基因編輯是競爭者較多的細(xì)分賽道。主要原因是體外基因編輯可以通過質(zhì)量控制保證基因編輯的質(zhì)量，將不達標(biāo)的細(xì)胞去除，從安全性的角度來看更為可靠，也更容易被監(jiān)管機構(gòu)所接受。從某個角度來說，體外基因編輯是利用基因編輯工具賦能細(xì)胞治療。目前的細(xì)胞治療，受制于細(xì)胞免疫機制，以自體型為主。但自體型細(xì)胞治療的缺陷也較為明顯：首先，由于所有細(xì)胞均來自于患者自身，因此成本較高，也無法規(guī)模生產(chǎn)，導(dǎo)致價格一直居高第二，由于每個患者接受的細(xì)胞治療都是個體化產(chǎn)品，因此制備所需時間較長。同時，治療過程較為繁瑣，對患者的生理和心理的消耗較大。由于自體型細(xì)胞治療有著上述的種種缺陷，通用型（Allogeneic）細(xì)胞治療吸引了大量關(guān)注。相較于自體型細(xì)胞治療，通用型細(xì)胞治療的優(yōu)勢在于：環(huán)節(jié)減少，不需要從患者體內(nèi)提取細(xì)胞，減少患者負(fù)擔(dān)。產(chǎn)品一致性更佳，因此有望實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，成本可能降低。但挑戰(zhàn)也隨之而來，自體型細(xì)胞治療最大的障礙便是降低免疫排異反應(yīng)。排異反應(yīng)來自多個人體免疫機制，例如T細(xì)胞和NK細(xì)胞（與HLA基因相關(guān)）。同時，若輸注的治療細(xì)胞量較大的話，輸注細(xì)胞可能會對人體細(xì)胞產(chǎn)生排異（與TCR相關(guān)）（GvHD）。圖表22：細(xì)胞治療受到多種細(xì)胞免疫排異機制的抵抗資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券29基因編輯改造細(xì)胞，盡量避免不需要的免疫機制通過基因編輯，盡量干擾或阻斷引起排異反應(yīng)的信號通路。圖表23：Intellia降低排異反應(yīng)的策略資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券Intellia在此提供了一些可能的改進思路。例如：通過敲除治療細(xì)胞的TCR來避免移植物排斥宿主?。℅vHD通過基因敲入引入CAR或TCR來增強細(xì)胞對腫瘤的殺傷；敲除II型HLA基因來避免CD-4介導(dǎo)的排異反應(yīng)；敲除HLA-A來避免CD-8介導(dǎo)的排異反應(yīng)；調(diào)整HLA-B和HLA-C來避免NK細(xì)胞介導(dǎo)的排異反應(yīng)。圖表24：CRISPRTherapeutics降低排異反應(yīng)的策略資料來源：CRISPRTherapeutics，中銀證券CRISPRTherapeutics第一代體外基因編輯產(chǎn)品設(shè)計也遵循類似的設(shè)計理念：通過敲除β2M來去除MHC1的表達，使CAR-T細(xì)胞不容易被患者的免疫系統(tǒng)識別；通過干擾TCR的表達，使CAR-T細(xì)胞不再排斥患者體內(nèi)的細(xì)胞；利用CRISPR技術(shù)，將CAR序列精準(zhǔn)插入至TRAC位點，提高一致性和安全性。30基因編輯改造細(xì)胞，加強對腫瘤細(xì)胞的殺傷力通過基因編輯，除了可以干擾或阻斷引起排異反應(yīng)的信號通路，也可以增強治療細(xì)胞的有效性。CRISPRTherapeutics第二代體外基因編輯產(chǎn)品是針對腫瘤的一款細(xì)胞治療，產(chǎn)品設(shè)計在第一代基礎(chǔ)上繼續(xù)改進：通過干擾Regase-1的表達，使細(xì)胞素分泌增加，增強對腫瘤細(xì)胞的毒性；敲除TGFBR2，使CAR-T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞分泌的TGF-β不再敏感，加強殺傷。圖表25：CRISPRTherapeutics第二代CAR-T設(shè)計資料來源：CRISPRTherapeutics，中銀證券圖表26：CRISPRTherapeutics第二代CAR-T設(shè)計原理資料來源：CRISPRTherapeutics，中銀證券CRISPRTherapeutics第一代體外基因編輯產(chǎn)品的設(shè)計主要利用基因編輯技術(shù)增強了產(chǎn)品的安全性，避免不必要的免疫排斥。第二代體外基因編輯產(chǎn)品設(shè)計在第一代基礎(chǔ)上的改進主要是為了增強工程細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷力。對不同基因的編輯，給細(xì)胞治療帶來了更大的設(shè)計空間，更多的改進方向。31尋找合適的策略和編輯位點，考驗研發(fā)機構(gòu)對細(xì)胞機制的理解水平基因編輯提供了有力的改進細(xì)胞治療的方法和工具箱。如何利用好基因編輯，使基因編輯發(fā)揮最大的效益，考驗研發(fā)團隊對細(xì)胞機制的理解水平。CRISPRTherapeutics提供了一個范例。CRISPRTherapeutics的研發(fā)人員們發(fā)現(xiàn)，CAR-T細(xì)胞不需過長的體內(nèi)留存時間。CAR-T細(xì)胞在人體內(nèi)的PK特征呈現(xiàn)較明顯的3個階段。第一階段CAR-T細(xì)胞尋找腫瘤所在的靶點；第二階段CAR-T細(xì)胞開始擴增，攻擊腫瘤細(xì)胞；第三階段，CAR-T細(xì)胞被自身免疫系統(tǒng)清除。研究發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞進入體內(nèi)后便內(nèi)快速響應(yīng)，一般不需留存28天便能實現(xiàn)持續(xù)的病情緩解。此外，NK細(xì)胞未在腫瘤處聚集，意味著繼續(xù)降低CAR-T免疫原性的收益不高。因此，研發(fā)團隊轉(zhuǎn)向?qū)ふ姨岣哂行缘姆桨浮D表27：CRISPRTherapeuticsCAR-T產(chǎn)品CTX130藥代動力學(xué)特征資料來源：CRISPRTherapeutics，中銀證券圖表28：NK細(xì)胞未在病灶聚集，說明NK細(xì)胞對CAR-T細(xì)胞干擾有限資料來源：CRISPRTherapeutics，中銀證券隨后，CRISPRTherapeutics的研發(fā)團隊對各位點以及組合進行了研究篩選，找到腫瘤抑制效果最好的組合，將其納入新一代藥物的工程化改造策略中。AI可能能夠提高這一篩選過程的效率。32圖表29：對不同位點和組合進行改造，探究腫瘤抑制的最佳策略資料來源：CRISPRTherapeutics，中銀證券體外基因編輯特點特點1：相較于體內(nèi)，體外基因編輯安全性、可控性更佳。特點2：許多體外基因編輯管線可以看作是細(xì)胞治療的升級，是使用基因編輯技術(shù)賦能細(xì)胞治療，改善治療細(xì)胞的免疫原性、提高安全性、增強針對腫瘤細(xì)胞的殺傷力（若適應(yīng)癥為癌癥）。特點3：針對不同適應(yīng)癥，可進行不同的設(shè)計，使治療細(xì)胞的不同能力得到加強。特點4：基因編輯提供了大量細(xì)胞治療升級的可能性，但哪些方向、策略最有價值，非?？简炑邪l(fā)團隊對細(xì)胞機制的理解和積累。AI在其中可能能夠提升篩選效率。特點5：CRISPRTherapeutics與Vertex合作開發(fā)的Exa-cel有望成為首個獲批的基因編輯療法。該產(chǎn)品用于治療TDT和SCD的上市申請已于2023年1月獲EMA受理，于2023年4月3日完成了向FDA提起的BLA。Exa-cel已獲得FDA授予的RMAT、快速通道、孤兒藥認(rèn)證，和EMA授予的優(yōu)先藥物（PRIME）認(rèn)證。33全球研發(fā)進展NTLA-2001是IntelliaTherapeutics目前進展最快的管線之一。NTLA-2001用于治療由轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（TransthyretinAmyloidosis，ATTR）引起的疾病。目前已開展了2項臨床I期研究，分別針對由ATTR引起的多發(fā)性神經(jīng)疾病和心肌疾病。ATTR蛋白淀粉樣變性是由于錯誤折疊的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白不斷積累產(chǎn)生的。ATTR主要影響神經(jīng)及心臟功能。根據(jù)Intellia官網(wǎng)2023Q1CorporateOverview信息，全球范圍內(nèi)，受遺傳性ATTR困擾的患者規(guī)模約50000人，野生型ATTR患者20-50萬人。ATTR伴隨心肌疾病患者診斷后的預(yù)期生存周期約2-7年，ATTR伴隨多發(fā)性神經(jīng)疾病患者的預(yù)期生存期約10年。ATTR可能引起多種不良反應(yīng)，例如心衰、呼吸困難、虛弱、知覺喪失等，且治療通常需要延續(xù)一生，疾病負(fù)擔(dān)較重。研究證明TTR基因表達的抑制，可以改善ATTR引起的多發(fā)性神經(jīng)疾病的癥狀。此前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的首個siRNA藥物Patisiran（商品名Onpattro，由Alnylam公司研發(fā)）通過小核酸干擾機制抑制TTR蛋白的表達，改善了患者癥狀。在Patisiran的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)改良神經(jīng)病變損傷評分mNIS+7與轉(zhuǎn)甲狀腺素水平有著密切聯(lián)系。圖表30：轉(zhuǎn)甲狀腺素水平與mNIS+7神經(jīng)損傷評分關(guān)系資料來源：NEJM，中銀證券目前全球?qū)τ贏TTR的治療手段非常匱乏。在2017年FDA批準(zhǔn)siRNA藥物Patisiran上市前，幾乎沒有有效藥物，只能通過肝臟移植以及僅在部分國家獲批的氯苯唑酸進行治療。ATTR是一種典型的醫(yī)療需求未被滿足的罕見病。近年來，F(xiàn)DA陸續(xù)批準(zhǔn)了Onpattro、Amvuttra、Tegsedi、Vyndamax、Vyndaqel用于ATTR引起的不同病癥。但上述藥物價格都較為昂貴。34圖表31：現(xiàn)有用于治療ATTR的相關(guān)藥物資料來源：Businesswire,ATTR是一種典型的醫(yī)療需求未被滿足的罕見病。隨著RNA藥物、基因治療和基因編輯技術(shù)的進步，許多公司將ATTR作為最早的研發(fā)管線目標(biāo)之一。近年來，隨著RNA藥物、基因治療和基因編輯技術(shù)的進步，許多公司將ATTR作為最早的研發(fā)管線目標(biāo)之一。臨床設(shè)計Intellia的NTLA-2001已進入臨床I期研究，這是一項針對2項適應(yīng)癥進行的開放標(biāo)簽、多中心研究。研究分別對藥物在遺傳性ATTR引起的多發(fā)性神經(jīng)疾?。ˋTTRv-PN）和ATTR引起的心肌疾病（ATTR-CM）的治療展開了探索。兩個適應(yīng)癥的給藥方式均采取1劑次靜脈注射（IV）。兩個適應(yīng)癥的研究均分為兩個部分，第一部分為單劑次劑量爬坡，第二部分為劑次擴張（以第一部分研究后選定的劑量為基礎(chǔ)）。35圖表32：NTLA-2001臨床I期研究設(shè)計資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券主要臨床終點為安全性、耐受性、PK及PD，對血清TTR水平進行監(jiān)測。次要臨床終點分別對神經(jīng)功能和心臟類疾病進行監(jiān)測評判。針對ATTRv-PN多發(fā)性神經(jīng)疾病，單劑量爬坡研究設(shè)置的劑量組分別為1.0mg/kg、0.7mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg。次要臨床終點中的評判標(biāo)準(zhǔn)為NIS（神經(jīng)損傷評分，neuropathyimpairmentscore）和mNIS+7（改良神經(jīng)損傷評分+7，modifiedNIS+7）。圖表33：NTLA-2001臨床I期針對多發(fā)性神經(jīng)疾?。ˋTTRv-PN）的設(shè)計資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券針對ATTR-CM心肌疾病，單劑量爬坡研究中，研究者根據(jù)NYHA分類將患者分為3個組別：針對I型/II型患者給藥0.7mg/kg、針對III型患者給藥0.7mg/kg、針對I型/II型患者給藥1.0mg/kg。次要臨床終點的評判中包含了心電圖、生物標(biāo)記物、心肺測試、6分鐘行走測試。36圖表34：NTLA-2001臨床I期針對心肌疾病（ATTR-CM）的設(shè)計資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券NTLA-2001在兩項適應(yīng)癥的研究中均出現(xiàn)了較高的不良反應(yīng)概率。在針對多發(fā)性神經(jīng)疾?。ˋTTRv-PN）的研究中，所有15個受試者均出現(xiàn)了不良反應(yīng)，其中1級不良反應(yīng)73.33%（11/152級不良反應(yīng)13.33%（2/153級不良反應(yīng)13.33%（2/15）。按劑量組來看，2級和3級不良反應(yīng)案例均出現(xiàn)在0.7mg/kg和1.0mg/kg兩個高劑量組，兩個低劑量組（0.1mg/kg、0.3mg/kg）出現(xiàn)的不良反應(yīng)均為1級。圖表35：NTLA-2001臨床I期針對遺傳性ATTR引起的多發(fā)性神經(jīng)疾病（ATTRv-PN）的安全性資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券在針對心肌疾?。ˋTTR-CM）的研究中，在共12人的受試者中9人（75%）出現(xiàn)了不同程度的不良反應(yīng)，其中，共2級不良反應(yīng)出現(xiàn)概率16.67%（2/12）和3級不良反應(yīng)8.33%（1/12）。不良反應(yīng)的出現(xiàn)概率、程度、以及具體原因仍舊需要繼續(xù)觀察。37圖表36：NTLA-2001臨床I期針對ATTR引起的心肌疾病（ATTRv-CM）的安全性資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券總體而言，NTLA-2001安全性數(shù)據(jù)有以下特點：不良反應(yīng)出現(xiàn)概率較高。輕度不良反應(yīng)為主。以上數(shù)據(jù)由于樣本量較小，不一定能準(zhǔn)確反映藥物安全性特征。此外，與現(xiàn)有的其他ATTR藥物對比，NTLA-2001整體安全性呈類似水平和特征。FDA于2017年批準(zhǔn)用于治療ATTR的siRNA藥物Patisiran此前公布的臨床III期數(shù)據(jù)顯示，Patisiran引起不良反應(yīng)的概率約為97%。出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)（severeadverseevents）的概率為28%。38圖表37：siRNA藥物Patisiran臨床III期安全性數(shù)據(jù)資料來源：NEJM，中銀證券NTLA-2001在有效性方面顯示出令人興奮的競爭力?；颊咴诮邮躈TLA-2001治療后，體內(nèi)TTR水平受到明顯抑制，并且目前已有數(shù)據(jù)顯示藥效持續(xù)時間長。在對多發(fā)性神經(jīng)疾?。ˋTTRv-PN）的研究中，除最小劑量組0.1mg/kg外，其他劑量組（0.3、0.7、1.0mg/kg）均在給藥后1個月內(nèi)實現(xiàn)TTR降低80%以上，并且抑制作用持久。截至2022年6月24日，0.3mg/kg劑量組（n=3）跟蹤時間已到達給藥后12個月，期間TTR平均抑制效果保持在80%以上，第12個月時平均抑制效果約89%。0.7mg/kg劑量組（n=3）跟蹤時間到達給藥后6個月，期間TTR平均抑制效果保持在80%以上，第6個月時平均抑制效果約87%。1.0mg/kg劑量組（n=6）中有3位受試者跟蹤時間到達9個月，其余3人到達6個月；期間TTR平均抑制效果90%以上，第6個月、第9個月時平均抑制效果均在93%左右。所有劑量組在給藥后1個月內(nèi)，TTR抑制水平便已接近峰值，并且一直穩(wěn)定在峰值附近。39圖表38：ATTRv-PN臨床I期NTLA-2001降低血清TTR的有效性數(shù)據(jù)資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券在針對心肌疾?。ˋTTR-CM）的研究中，NTLA-2001也顯示出良好的有效性。在所有三個干預(yù)組中，所有受試者的血清TTR水平在給藥后的第28天均下降了90%以上，并且維持在這一穩(wěn)定水平。截至2022年11月5日，NYHAI/II型患者接受0.7mg/kg的受試組到達給藥后6個月時間點，第6個月TTR平均抑制效果約93%，另外兩個組別到達給藥后4個月時間點，TTR平均抑制效果92%、94%。圖表39：ATTR-CM臨床I期NTLA-2001降低血清TTR的有效性數(shù)據(jù)資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券總體而言，NTLA-2001的有效性呈現(xiàn)以下特點：藥效明顯，受試者血清TTR含量顯著下降，降幅基本在80%以上。40藥效持久，受試者血清TTR受到持續(xù)穩(wěn)定的抑制。以目前數(shù)據(jù)來看，在最后觀察時間點，受試者TTR沒有出現(xiàn)反彈。起效較快。受試者血清TTR水平在給藥后1個月內(nèi)便能達到峰值或接近峰值抑制水平。此外，與現(xiàn)有的其他ATTR藥物對比，NTLA-2001整體有效性可能略有優(yōu)勢。FDA于2017年批準(zhǔn)用于治療ATTR的siRNA藥物Patisiran此前公布的臨床III期數(shù)據(jù)顯示，在給藥3周后，Patisiran對血清TTR的抑制效果基本穩(wěn)定在70%-80%區(qū)間。圖表40：Patisiran針對ATTR引起的心肌疾病臨床III期血清TTR降低幅度有效性數(shù)據(jù)資料來源：NEJM，中銀證券NTLA-2002是IntelliaTherapeutics另一條已進入臨床研究階段的管線。NTLA-2002用于治療遺傳性血管水腫（HereditaryAngioedema，HAE）。目前已開展了2項臨床I期研究，分別針對由ATTR引起的多發(fā)性神經(jīng)疾病和心肌疾病。HAE臨床表現(xiàn)為反復(fù)的、嚴(yán)重的、身體隨機部位的腫大。HAE對某些部位或器官的攻擊是非常危險的，例如咽喉部位的腫大可能導(dǎo)致窒息。HAE發(fā)病時間、部位隨機，嚴(yán)重時可導(dǎo)致住院或死亡。未經(jīng)治療的患者，平均7-14天便會受到HAE攻擊發(fā)病。HAE伴隨一生，目前的治療方法也需持續(xù)一生。全球范圍內(nèi)，平均每50000人中有1個HAE患者。美國與歐洲HAE患者超15000人。根據(jù)Intellia援引的GlobalData2022和Redbook2022數(shù)據(jù)，2026年全球市場空間可能達到40億美金。美國目前已有的預(yù)防性治療的年化治療費用約50萬美金。HAE疾病病理及NTLA-2002機制KLKB1基因?qū)allikrein（激肽釋放酶血管舒緩素）的水平起著重要作用，而Kallikrein對HMWKininogen（HMW激肽原）轉(zhuǎn)化Bradykinin（緩激肽）起促進作用。緩激肽是一種血管擴張劑，緩激肽過高可能引起水腫。NTLA-2002通過抑制KLKB1基因表達，控制緩激肽的水平，降低血管擴張造成的水腫的風(fēng)險。41圖表41：HAE疾病病理資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券圖表42：NTLA-2002治療HAE機制資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券臨床設(shè)計NTLA-2002臨床I期研究是一項開放標(biāo)簽的單劑量爬坡研究，分為3個劑量組：75mg（3人）、50mg（4人）、25mg（3人）。主要研究終點為安全性、耐受性，其他研究終點是PK、PD、有效性（發(fā)病數(shù)）。42臨床II期研究是一項對推薦劑量進行確認(rèn)的擴展隨機研究。分為3組：推薦劑量組1（10人）、推薦劑量組2（10人）、安慰劑組（5人）。主要研究終點是有效性（16周內(nèi)發(fā)病數(shù)其他研究終點包括PD、PK、安全性和耐受性、QoL生活質(zhì)量。圖表43：NTLA-2002臨床I/II期研究設(shè)計資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券研究證明了NTLA-2002的安全性和耐受性。所有劑量組中，最常出現(xiàn)的不良反應(yīng)是注射相關(guān)反應(yīng)和疲憊。所有不良反應(yīng)均為輕度（n=5）或中度（n=2）。所有不良反應(yīng)均自行緩解。未出現(xiàn)緊急嚴(yán)重不良反應(yīng)（emergentSAE）或三級及以上治療期不良反應(yīng)（TEAE）。受試者接受NTLA-2002給藥后，所有劑量組患者血清中Kallikrein水平明顯下降。所有劑量組給藥后28天內(nèi)，基本已達到最大抑制效果。25mg組抑制水平大約64%，75mg組抑制水平約92%，50mg組給藥后時間較短，尚不能確定抑制水平。43圖表44：NTLA-2002顯著降低血漿Kallikrein水平資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券更值得注意的是，NTLA-2002帶來了顯著的臨床癥狀改善。實驗時間較長的25mg組和75mg組患者在給藥后發(fā)病頻率明顯下降。25mg組中，患者在給藥后16周內(nèi)，平均發(fā)病頻率降低91%；75mg組這一數(shù)據(jù)為78%。圖表45：NTLA-2002帶來臨床獲益：降低HAE發(fā)病頻率資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券部分患者已可以不再接受傳統(tǒng)的預(yù)防治療。同時，觀察期較久的25mg組3名患者，分別已有10.6個44圖表46：NTLA-2002帶來臨床獲益：部分患者已可以不再接受傳統(tǒng)的預(yù)防治療資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券總體而言，NTLA-2002的有效性呈現(xiàn)以下特點：藥效明顯，且顯示出劑量依賴性。受試者血清Kallikrein含量顯著下降，且降幅與劑量正相關(guān)。已顯示出臨床獲益?；颊甙l(fā)病頻率顯著降低，部分患者已可脫離傳統(tǒng)預(yù)防治療，且在脫離后未有發(fā)病。部分患者距離上次發(fā)病已有數(shù)月時間。藥效持久，受試者血清Kallikrein受到持續(xù)穩(wěn)定的抑制。目前，在最后觀察時間點，受試者Kallikrein水平?jīng)]有出現(xiàn)反彈。更重要的是，部分患者距離上次發(fā)病已有數(shù)月時間，帶來了永久治愈的曙光。起效較快。受試者血清Kallikrein水平在給藥后28天內(nèi)便能達到峰值或接近峰值抑制水平。NTLA-3001是IntelliaTherapeutics進展最快的基因敲入管線，公司表示預(yù)計將在2023年下半年向FDA提交IND申請。Intellia目前布局了2條路徑，靶向AATDa)NTLA-3001：插入功能正常的SERPINA1基因，使A1AT蛋白持續(xù)正常表達。主要為解決AATD相關(guān)的肺疾病。b)NTLA-2003：敲除突變的SERPINA1基因，減少并防止錯誤的A1AT蛋白累積。主要解決AATD相關(guān)的肝疾病。AATD，Alpha-1AntitrypsinDeficiency，胰蛋白酶缺乏癥。是一種以血清中Alpha-1抗胰蛋白酶水平下降為主要特征的常染色體共顯性遺傳病。與新生兒肝炎、嬰幼兒和成人肝硬化、肺癌、肺氣腫等關(guān)系密切。發(fā)病時間、部位隨機，嚴(yán)重時可導(dǎo)致住院或死亡。未經(jīng)治療的患者，平均7-14天便會受到HAE攻擊發(fā)病。HAE伴隨一生，目前的治療方法也需持續(xù)一生。美國AATD患者超60000人，全球約25萬AATD患者。亞洲發(fā)病率較低，較為罕見。45在非人類靈長類（non-humanprimate，NHP）的臨床前研究顯示，基因敲入后，人A1AT（hA1AT）表達穩(wěn)定，即使在猴（Cyno）A1AT（cA1AT）基因被敲除后，cA1AT水平出現(xiàn)明顯下滑，但hA1AT表達仍舊基本穩(wěn)定在同一水平，說明敲入的hA1AT基因正在持續(xù)表達，并且不受cA1AT敲除的影響。圖表47：敲入基因可在非靈長類動物模型中成功表達資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券在嚙齒動物的臨床前研究顯示，敲入人FIX（hFIX）基因后，效果在12個月觀察期中持續(xù)存在，證明基因編輯的效果已經(jīng)被攜帶在正常的細(xì)胞循環(huán)中（與之相反，傳統(tǒng)藥物或治療帶來的效果會隨時間遞減，并逐漸消失）。隨后，研究團隊進行了部分肝臟切除（PHx），以探究基因編輯是否也會被攜帶進再生細(xì)胞中。圖表48：敲入基因是否在嚙齒類動物模型中持續(xù)表達設(shè)計思路資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券研究結(jié)果顯示，基因編輯的效果能夠被再生細(xì)胞繼承，對照組基因治療則無此能力。研究顯示，傳統(tǒng)的基因治療在肝臟部分切除后，敲入的基因表達明顯下降（第54天表達下降85%，第85天下降95%）。而基因編輯治療后，即使經(jīng)過肝臟部分切除，基因表達仍然明顯，且較為穩(wěn)定。說明基因編輯敲入的基因已被保存于動物模型的基因組中，有可能已實現(xiàn)了永久敲入。46圖表49：通過基因編輯敲入基因在肝部分切除后仍舊保持一定表達水平資料來源：IntelliaTherapeutics，中銀證券總體而言，NTLA-3001管線具有以下特點：已在非人類靈長類動物中獲得較成功的編輯，且表達持久。在非人類靈長類動物的研究中，顯示出定向編輯的能力。基因編輯的效果能夠被再生細(xì)胞繼承，基因治療則無此能力。這一能力證明了“一次給藥，永久治愈”的潛力。Intellia計劃在2023年下半年提交IND。Exa-cel是CRISPRTherapeutics與Vertex聯(lián)合研發(fā)的體外基因編輯療法，也是目前進展最快的基因編輯管線，公司表示該產(chǎn)品用于治療TDT和SCD的上市申請已于2023年1月獲EMA受理，于2023年4月3日完成了向FDA提起的BLA。Exa-cel的適應(yīng)癥為Beta地中海貧血(β-thalassemia）、鐮狀細(xì)胞性貧血（sicklecelldisease，SCD）。地中海貧血患者在出生后癥狀可能會進行性加重，并有可能由于嚴(yán)重貧血、心力衰竭、營養(yǎng)不足及感染導(dǎo)致死亡。鐮狀細(xì)胞癥可能會造成血管阻塞導(dǎo)致器官功能障礙，可能表現(xiàn)為疼痛危象、肝脾進行性腫大、組織缺氧、炎癥等。圖表50：地中海貧血患者紅細(xì)胞發(fā)生形變資料來源：Medlineplus，中銀證券47圖表51：鐮狀細(xì)胞癥患者紅細(xì)胞發(fā)生形變呈鐮刀狀資料來源：MayoClinics，中銀證券BCL11A基因位于2號染色體上。BCL11A會抑制新生兒血紅蛋白（fetalhemoglobin，HbF）的形成。新生兒血紅蛋白HbF能夠改善上述疾病的癥狀。通過體外基因編輯，研發(fā)團隊對CD34+HSPC細(xì)胞中紅細(xì)胞（erythroid）特異的BCL11A基因的加強子（enhancer）進行抑制，以此得到改造后的細(xì)胞并給患者進行回輸。圖表52：Exa-cel作用于BCL11A治療TDT/SCD資料來源：CRISPRTherapeutics，中銀證券首先需要對患者進行預(yù)前篩查，并收集患者自身的血液干細(xì)胞。而后，這些干細(xì)胞被送至生產(chǎn)中心進行基因編輯改造，以及安全性檢查，質(zhì)控通過后冷凍儲藏。同時，患者接受輸注前的準(zhǔn)備性化療，通常使用白消安（Busulfan，二甲磺酸丁酯）?；熃Y(jié)束后，患者接受治療細(xì)胞的輸注、移植。出院后持續(xù)進行跟蹤，了解預(yù)后情況。本質(zhì)上，Exa-cel是一個升級版的細(xì)胞治療產(chǎn)品。預(yù)計Exa-cel成本較高，定價也可能較昂貴。由于Exa-cel也是個體化方案，因此估計成本較高，定價可能會參考現(xiàn)有的