一種檢測禽流感病毒痕量h5亞型蛋白的間接免疫方法

一種檢測禽流感病毒痕量h5亞型蛋白的間接免疫方法

r-pcr技術(shù)是目前常用的快速診斷方法之一。然而,在禽感染初期,由于棉拭子中的病毒含量不足;或者病料、樣品的儲存不當(dāng)、運(yùn)送時間過長;或者RT-PCR等技術(shù)環(huán)節(jié)操作不當(dāng)、試驗(yàn)環(huán)境受污染,這些因素都有可能導(dǎo)致RT-PCR檢測結(jié)果呈現(xiàn)假陰性或假陽性的現(xiàn)象。免疫PCR是1992年Sano等建立的一種檢測微量蛋白的高靈敏度技術(shù)。該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機(jī)的結(jié)合起來,是迄今最敏感的抗原檢測方法之一。免疫PCR的基本原理是用一段已知的DNA分子來標(biāo)記特定的檢測抗體作為探針,然后用此探針與待檢抗原結(jié)合反應(yīng),然后通過PCR方法擴(kuò)增吸附在抗原抗體復(fù)合物上的這段標(biāo)記DNA分子,最終通過凝膠電泳或熒光技術(shù)等對待檢抗原進(jìn)行定性,結(jié)合特異性PCR產(chǎn)物的有無,判斷待檢抗原是否存在。免疫PCR技術(shù)已在很多相關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用,很多學(xué)者在對腫瘤標(biāo)記物或細(xì)胞因子、致病微生物、寄生蟲感染以及毒素等醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的研究取得了很好的效果。本研究以禽流感病毒H5血凝素蛋白為檢測對象,通過親和素-生物素的橋聯(lián)作用,建立了間接免疫PCR和間接“三明治”免疫PCR,初步研究和評價了免疫PCR技術(shù)對禽流感病毒檢測的效果和意義。1材料和方法1.1pcr擴(kuò)增條件利用5′生物素標(biāo)記的上游引物:F:biotin-5′-GGGATAACGCAGGAAAGAA-3′和下游引物R:5′-CAGGGTCGGAACAGGAGA-3′,以pUC19為DNA模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備報告DNA(218bp)。50μLPCR體系:上游引物F(20pmol·L-1)、下游引物R(20pmol·L-1)、Mg2+(2.5mol·L-1)、dNTP(mixture),0.4mmol·L-1,Taq酶(2.5U),DNA模板10ng。PCR擴(kuò)增條件:94℃30s,55℃30s,72℃1min,30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后作為免疫PCR報告DNA。本試驗(yàn)用DNAFragmentPurificationkit(TaKaRa)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。1.2抗aiv/h蛋白單抗c以溶液A(0.05mol·L-1,pH9.6的碳酸鹽緩沖液)對AIV/H5血凝素蛋白(重組蛋白,)進(jìn)行2倍系列稀釋,使其濃度為2000～2ng·L-1,分別取50μL不同濃度的H5血凝素蛋白稀釋液于TopYield板,4℃過夜包被(16h以上)。包被板用溶液B(洗滌液:含有1%Tween-20和0.1mmol·L-1EDTA的PBS液)洗滌5次。然后取200μL溶液C-1(封閉液:含有1%BSA、0.2%的甘氨酸的溶液B)于各板孔內(nèi),放置37℃感作1h。洗板,在各孔中加入50μL抗AIV/H5蛋白單抗(以溶液D將其稀釋為1μg·mL-1工作濃度,溶液D為含有0.1%Tween-20和0.5%BSA的PBS液),置37℃感作1h。洗板,取50μL以溶液D稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG溶液(1∶5000),分別將其加入各板孔內(nèi),置37℃感作1h。洗板,在各孔中加50μL用溶液D稀釋的鏈親合素并置37℃感作1h。洗板,在各孔中加50μL以溶液D稀釋偶聯(lián)有HRP的生物素溶液(1∶10000),置37℃感作1h。繼續(xù)以溶液B洗板5次,然后在在各孔中加100μLTMB底物溶液,置37℃感作30min,然后用2mol·L-1H2SO4溶液終止反應(yīng),并將反應(yīng)板置酶標(biāo)儀內(nèi),以450nm波長的可見光掃描,記錄檢測數(shù)據(jù)(OD值)。1.3鏈親和素對aiv/h血凝素蛋白表達(dá)的影響以溶液A(0.05mol·L-1,pH9.6的碳酸鹽緩沖液)對AIV/H5血凝素蛋白的單抗進(jìn)行稀釋,使其濃度為1μg·mL-1,分別在TopYield板各孔中加50μLAIV/H5血凝素蛋白單抗稀釋液,4℃過夜包被(16h)。洗板5次,在各板孔內(nèi)加200μL封閉液,置37℃1h。洗板后加50μL以緩沖液D進(jìn)行2倍系列稀釋的不同濃度的AIV/H5蛋白溶液(蛋白濃度范圍2000～2ng·L-1),置37℃感作1h。洗板5次,在各孔中分別加50μL兔抗AIV/H5的IgG(揚(yáng)州大學(xué)提供,以溶液D將其稀釋為1μg·mL-1工作濃度),并置37℃感作1h。洗板5次,在各孔中分別加50μL以生物素標(biāo)記的羊抗兔的IgG稀釋液(1∶5000,溶液D稀釋),置37℃感作1h。添加鏈親和素之后的程序同1.2間接ELISA方法相應(yīng)部分。為了準(zhǔn)確檢測AIV/H5血凝素蛋白,確保檢測的特異性和準(zhǔn)確性,在間接ELISA和間接SandwichELISA試驗(yàn)中,對鏈親和素的使用濃度進(jìn)行了優(yōu)化和確定。以溶液D將鏈親和素稀釋為0.01、0.1、1μg·mL-13個不同濃度的稀釋液,分別取這3個不同濃度的鏈親和素溶液進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。1.4pcr擴(kuò)增條件間接免疫PCR檢測AIV/H5蛋白的步驟基本同間接ELISA方法。與ELISA方法不同之處在于與生物素偶聯(lián)的HRP(辣根過氧化物酶)在免疫PCR中被生物素標(biāo)記的報告DNA分子取代,免疫PCR試驗(yàn)所用的封閉液添加了終濃度為1g·L-1鮭魚精DNA的溶液。在各孔中加50μL鏈親合素溶液37℃孵育1h后,洗滌液洗板10次,在各孔中加50μL以溶液D稀釋的生物素標(biāo)記的報告DNA分子,置37℃孵育1h。先用洗滌液洗板15次,然后用雙蒸水洗滌3次。在TopYield各板孔中分別按照PCR擴(kuò)增體系,添加PCR反應(yīng)液,對板內(nèi)結(jié)合的報告DNA進(jìn)行PCR檢測。本試驗(yàn)選用TaKaRaoneshotLAPCRTMmix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50μLPCR體系主要包含:上游引物F(20pmol·L-1,)、下游引物R(20pmol·L-1)、Mg2+(2.5mmol·L-1)、dNTP(Mixture),0.4mmol·L-1,Taq酶(2.5U)。PCR擴(kuò)增條件:94℃30s,55℃30s,72℃1min,30個循環(huán)。本試驗(yàn)的PCR反應(yīng)產(chǎn)物(218bp)通過2%瓊脂糖凝膠(Gelred染色)在90V電壓條件下電泳25min,然后通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。1.5報告dna的pcr檢測間接Sandwich免疫PCR方法檢測AIV/H5蛋白的步驟基本同間接SandwichELISA方法。與SandwichELISA不同的是生物素偶聯(lián)的HRP(辣根過氧化物酶)被生物素標(biāo)記的報告DNA分子取代,免疫PCR試驗(yàn)所用的封閉液添加了終濃度為1g·L-1鮭魚精DNA的溶液。在板孔中加50μL用溶液D稀釋的鏈親合素并置37℃孵育1h,洗滌液洗板10次,在各孔中加50μL以溶液D稀釋的生物素標(biāo)記的報告DNA分子,置37℃孵育1h。先以洗滌液洗板15次,然后用雙蒸水洗滌5次后,在TopYield各板孔中分別按照PCR擴(kuò)增體系,添加PCR反應(yīng)液,對板內(nèi)結(jié)合的報告DNA進(jìn)行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系和條件同1.4。PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳(Gelred染色)后觀察檢測結(jié)果。1.6間接免疫pcr檢測為了驗(yàn)證免疫PCR方法檢測H5亞型禽流感病毒的效果以及其特異性,本研究采用優(yōu)化的間接Sandwich免疫PCR方法,參照1.5步驟分別對滅活的H5亞型禽流感病毒(AIV/H5)、H7亞型禽流感病毒(AIV/H7)、H9亞型禽流感病毒(AIV/H9)、新城疫病毒(NDV)、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)進(jìn)行了免疫PCR檢測。2結(jié)果2.1鏈親和素濃度對elisa檢測結(jié)果的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1、2),當(dāng)鏈親和素濃度為1μg·mL-1時,ELISA檢測試驗(yàn)出現(xiàn)明顯的非特異性反應(yīng)。當(dāng)鏈親和素濃度為0.01μg·mL-1時,ELISA檢測不敏感,在檢測不同濃度的H5蛋白時,檢測信號呈現(xiàn)一定程度的飽和現(xiàn)象。而當(dāng)鏈親和素濃度為0.1μg·mL-1時,ELISA檢測試驗(yàn)未出現(xiàn)明顯的非特異性反應(yīng),而且檢測信號與檢測病原的劑量的相關(guān)性良好。由此可看出,鏈親和素的使用濃度對ELISA檢測有著非常重要的影響。2.2報告dna的濃度本試驗(yàn)將報告DNA進(jìn)行10倍系列稀釋,使其濃度分別為1000～0.001ng·mL-1。免疫PCR試驗(yàn)中分別使用不同濃度的報告DNA,試驗(yàn)過程中除不添加AIVH5蛋白和鏈親和素外,檢測體系的其它檢測試劑和步驟完全同1.4、1.5。試驗(yàn)結(jié)果顯示,PCR產(chǎn)物的濃度與報告DNA使用濃度呈現(xiàn)劑量的依賴型,當(dāng)報告DNA的濃度小于10ng·mL-1時,PCR條帶完全消失。因此,將10ng·mL-1確定為免疫PCR檢測試驗(yàn)中報告DNA的最佳使用濃度。2.3鏈親合素對aiv5蛋白表達(dá)的免疫pcr檢測結(jié)果ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示,高濃度的鏈親和素環(huán)境下,ELISA檢測結(jié)果出現(xiàn)明顯的非特異性反應(yīng)。為了最大程度上降低非特異性反應(yīng),在試驗(yàn)中必須對不同濃度鏈親合素下免疫PCR的檢測效果進(jìn)行比較和綜合評價。本研究以200ng·L-1的AIVH5蛋白為檢測目標(biāo)(每孔10pg),選擇最佳濃度的報告DNA(10ng·mL-1)進(jìn)行免疫PCR試驗(yàn)。在間接免疫PCR和間接Sandwich免疫PCR試驗(yàn)中,取濃度分別為1000、100、10和1ng·mL-1鏈親合素進(jìn)行免疫PCR試驗(yàn)。試驗(yàn)具體操作步驟同1.4、1.5。結(jié)果顯示當(dāng)鏈親合素濃度分別為1000、100、10和1ng·mL-1時,含AIVH5蛋白的檢測孔中都有PCR產(chǎn)物擴(kuò)增,在不含AIVH5蛋白的對照孔中,鏈親合素濃度分別為1000、100ng·mL-1的檢測孔出現(xiàn)非特異性的PCR擴(kuò)增,鏈親合素濃度小于10ng·mL-1時,無非特異性的PCR擴(kuò)增。因此,本試驗(yàn)選擇10ng·mL-1為免疫PCR體系的最佳鏈親合素工作濃度。2.4elisa試驗(yàn)和aiv/h蛋白檢測限的比較間接ELISA檢測AIVH5蛋白的試驗(yàn)中,將不同濃度AIV/H5蛋白直接包被TopYield板,以抗AIV/H5蛋白單克隆抗體作檢測抗體(以正常小鼠腹水為對照),進(jìn)行免疫PCR檢測。間接ELISA檢測限的閾值設(shè)定:以健康小鼠腹水為對照OD值的平均值與2個標(biāo)準(zhǔn)差的總和所對應(yīng)的病原檢測量為該試驗(yàn)的檢測限。根據(jù)計(jì)算結(jié)果,間接ELISA試驗(yàn)對AIV/H5蛋白的檢測限約為780fg(圖3)。間接SandwichELISA檢測AIVH5蛋白的試驗(yàn)中,以抗AIV/H5蛋白單抗作捕獲抗體,以兔抗AIV/H5蛋白的多抗作檢測抗體(健康兔血清作對照),進(jìn)行免疫PCR試驗(yàn)。檢測限的閾值設(shè)定:以正常兔血清OD值的平均值與2個標(biāo)準(zhǔn)差的總和所對應(yīng)的病原檢測量為該試驗(yàn)的檢測限。結(jié)果顯示(圖4),SandwichELISA試驗(yàn)對AIV/H5蛋白的檢測限約為780fg。2.5自身蛋白檢測以最適濃度的鏈親和素(10ng·mL-1),最適濃度的報告DNA(10ng·mL-1)進(jìn)行的間接免疫PCR和間接“三明治”免疫PCR進(jìn)行AIV/H5蛋白的檢測試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5、6),2種免疫PCR方法檢測AIV/H5蛋白的檢測限均約為1fg。2.6檢測限和檢測限應(yīng)用傳統(tǒng)的ELISA方法(間接法和間接Sandwich法)對AIV/H5蛋白進(jìn)行檢測,其檢測限為780fg。應(yīng)用免疫PCR方法(間接法和間接Sandwich法)對相同的病原進(jìn)行檢測,該方法的檢測限為1fg。通過比較可明顯看出,在對相同濃下的AIV/H5蛋白的檢測中,免疫PCR方法比傳統(tǒng)的ELISA方法的靈敏性高出近103倍。2.7病毒核酸檢測本研究選擇最適濃度的鏈親和素和報告DNA濃度,根據(jù)建立的免疫PCR方法,分別對滅活H5亞型禽流感病毒(AIV/H5)、H7亞型禽流感病毒(AIV/H7)、H9亞型禽流感病毒(AIV/H9)、新城疫病毒(NDV)、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示(圖7),本研究建立的免疫PCR方法可成功檢測出H5亞型禽流感病毒,而對照病毒的免疫PCR結(jié)果均為陰性,免疫PCR檢測H5亞型禽流感病毒的特異性良好。3討論3.1na的檢測免疫PCR中,高純度且異源性的報告DNA也有助于獲得良好的試驗(yàn)結(jié)果。免疫PCR中的報告DNA分子應(yīng)盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA。本試驗(yàn)選用pUC19DNA作為免疫PCR的報告分子是基于該報告分子中含有amp抗性基因、lacZ基因、限制性酶切位點(diǎn)基因等。因?yàn)檫@些基因與大多生物學(xué)物種的基因序列完全不同,因此可大大避免或減少DNA交叉污染的問題,從而提高免疫PCR檢測技術(shù)的準(zhǔn)確性。另外,由于報告DNA與AIV核酸(RNA)都不同源,因此PCR檢測具有很清晰的檢測背景,這也有助于控制假陽性的產(chǎn)生。與常規(guī)禽流感病毒RT-PCR檢測相比,本試驗(yàn)不需要反轉(zhuǎn)錄的過程。因此,該技術(shù)對快速檢測類RNA核酸類型的病毒具有很實(shí)用的意義。3.2elisa試驗(yàn)和血清白蛋白檢測試驗(yàn)由于免疫PCR檢測是基于對抗原的直接或間接捕獲在固相載體中,不充分的封閉對檢測的靈敏性和特異性有很大影響。與此同時,封閉試劑的選擇對非特異性結(jié)合的影響非常重要,脫脂奶粉和牛血清白蛋白(BSA)是各研究學(xué)者一致認(rèn)為最好的封閉試劑。本試驗(yàn)通過使用適量的BSA結(jié)合鮭魚精DNA做封閉劑來飽和檢測板中的可吸附位點(diǎn)而大大減小了非特異性結(jié)合的可能性。另外,本試驗(yàn)增加洗滌次數(shù),充分保證檢測背景的清晰,對提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性起到良好的效果。ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示,在高濃度的鏈親和素環(huán)境下,ELISA檢測結(jié)果出現(xiàn)明顯的非特異性反應(yīng)。在免疫PCR檢測試驗(yàn)中,為了最大程度上降低非特異性反應(yīng),在試驗(yàn)中必須對不同濃度鏈親合素下免疫PCR的檢測效果進(jìn)行比較和綜合評價,選擇最佳濃度的鏈親和素,進(jìn)行免疫PCR檢測試驗(yàn)。3.3免疫pcr檢測目前,對禽流感病毒的檢測大多都針對活禽鼻喉棉拭子或直接對禽類制品進(jìn)行活毒檢測,病毒分離是檢測禽流感病毒最傳