實驗五 原核表達

實驗五原核表達實驗五原核表達一、原理1、E.coli表達系統(tǒng)E.coli是重要的原核表達體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E.coli

菌株以后，通過溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達目的蛋白質(zhì)，將表達樣品進行SDS以檢測表達蛋白質(zhì)。本實驗采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達實驗五原核表達2.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）

使用含有十二烷基硫酸鈉（SDS）和還原劑（通常為巰基乙醇）的樣品處理液對蛋白質(zhì)樣品進行處理（一般煮沸3-5分鐘），通過加熱和SDS可以使蛋白質(zhì)變性，多亞基的蛋白質(zhì)也將解離為單亞基。實驗五原核表達SDS是變性劑，它能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。巰基乙醇打開二硫鍵，因此使蛋白質(zhì)分子處于伸展?fàn)顟B(tài)。聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點

實驗五原核表達

蛋白質(zhì)在電場中的遷移率取決于它所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。

加入SDS（十二烷基磺酸鈉）和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它的分子量，而與原來所帶電荷、分子形狀無關(guān)。

實驗五原核表達電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。混合樣品帶孔膠

按分子大小分離電泳方向

電泳

小分子大分子實驗五原核表達實驗五原核表達二、試劑LB培養(yǎng)基SOC培養(yǎng)液50μg/mLAmpIPTG

SDSLoadingBuffer

實驗五原核表達實驗五原核表達SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：試劑30%丙烯酰胺凝膠貯液：丙烯酰胺30g，N,N-亞甲雙丙烯酰胺0.8g4×Tris·Cl/SDSpH8.8：18.2gTris堿溶解于40mL水中，用1mol/L的鹽酸調(diào)pH為8.8后，定容到100mL，再加0.4gSDS。4×Tris·Cl/SDSpH6.8：6.05gTris堿溶解于40mL水中，用1mol/L的鹽酸調(diào)pH為6.8后，定容到100mL，再加0.4gSDS。實驗五原核表達樣品緩沖液：1mL4×Tris·Cl/SDS(pH6.8)，1gSDS，2mLβ-巰基乙醇，1mL0.1%溴酚蘭，5mL甘油，加蒸餾水定容到50mL。電極緩沖液：0.6gTris堿，2.88g甘氨酸，0.1gSDS固定液：50%甲醇，10%冰醋酸染色液：0.05%(w/v)考馬斯亮藍(lán)R-250，50%甲醇，10%冰醋酸脫色液：7%冰醋酸，5%甲醇實驗五原核表達

三、設(shè)備實驗五原核表達實驗五原核表達四、步驟1.E.coliBL21(DE3)感受態(tài)的制備2.重組子轉(zhuǎn)化BL211）在預(yù)冷的EP管中加入1μL質(zhì)粒DNA，加入200μLBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，混勻后在冰浴上靜置30min。2）42℃水浴熱沖擊30s，冰浴上放置10min，加入0.8mLSOC培養(yǎng)液。置于37℃振蕩培養(yǎng)1h。3）取0.1mL涂布于加有抗生素的LB培養(yǎng)基平板（50μg/mLAmp）上，37℃培養(yǎng)過夜。

實驗五原核表達3.原核表達1)挑取上述方法得到的單菌落于2mLLB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素50μg/mL)中。同時，BL21作為對照（不加抗生素）。于37℃培養(yǎng)至OD600為0.5.2)取20μL菌液接種2mLLB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素50μg/mL),37℃培養(yǎng)OD600為0.5，3)加入IPTG最終濃度梯度2mM，18℃誘導(dǎo)表達16h。實驗五原核表達4)誘導(dǎo)結(jié)束后，用超聲波破碎細(xì)胞。5）1mL菌液加入100μL的SDSLoadingBuffer，100℃煮沸5min。6）取30μL上清樣品點樣，分析SDS膠，觀察表達結(jié)果。實驗五原核表達4.SDS1)按下表配方制備SDS凝膠，加樣。先10mA恒流電泳至分離膠，再調(diào)為15mA恒流到電泳結(jié)束。實驗五原核表達SDS膠配方組分12%分離膠(mL)3.9%濃縮膠(mL)丙烯酰胺貯液60.654×Tris·Cl/SDS,pH8.83.754×Tris·Cl/SDS,pH6.81.25ddH2O5.253.0510%過硫酸銨

0.050.025TEMED

0.010.005實驗五原核表達2)考馬斯亮藍(lán)染色（1）：將聚丙烯酰胺凝膠用固定液