測定食品中蛋白質(zhì)含量

Lowry-Folin法測定食品中蛋白質(zhì)含量食品學(xué)院第7組S100111029王婷一、 實驗?zāi)康模菏煜げ⑹褂梅止夤舛扔?。學(xué)習(xí)并理解Lowry-Folin法測定食品中蛋白質(zhì)含量的方法。二、 實驗原理：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅鹽可產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，產(chǎn)生絡(luò)合物，此絡(luò)合物會將磷鉬酸-磷鎢酸（Folin）試劑還原，產(chǎn)生深藍色絡(luò)合物。在一定條件下，藍色深淺與蛋白質(zhì)的量成正比。在波長540nm處測定樣品的吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，可確定蛋白質(zhì)的含量。這種方法是檢測可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的金典方法之一。三、 實驗試劑：試劑A：稱取Na2CO3100g溶于1000ml（最終體積）0.5mol/LNaoH中。試劑B：稱取CuSO4-5H2O1.0g溶于100ml（最終體積）蒸餾水中。試劑C：稱取酒石酸鉀鈉2.0g溶于100ml（最終體積）蒸餾水中。牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白，配成濃度為200ug/ml的溶液。5.2mol/LFolin-酚試劑：于2L的磨口燒瓶中加入100g鎢酸鈉（Na2WO4?2H2O）、25g鉬酸鈉（Na2MO4-2H2O）＞700ml蒸餾水，在加入85%磷酸溶液50ml以及濃鹽酸100ml，充分混合，接上冷凝管，回流10h?；亓魍戤叄尤?50g硫酸鋰、50ml蒸餾水和濃漠水（90%）數(shù)滴，開口繼續(xù)煮沸15min，以除去多余的漠（冷卻后如仍然有綠色需再加漠水，在煮沸）。冷卻后加水定容至100ml?；靹?，過濾，制的的試劑應(yīng)呈金黃色，置于棕色瓶中保存。使用時一酚酞作為指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，用蒸餾水稀釋（本處為10倍），使其達到所需濃度。四、 實驗步驟：標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：（1）取10ml具塞試管6支，編號，分別準(zhǔn)確吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml血清蛋白溶液置于相應(yīng)的試管中。在各支試管中分別加入1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00ml的蒸餾水，使其總體積達到1ml。

不同濃度BSA溶液的配制編號0（空白）12345BSA(ml)00.200.400.600.801.00水(ml)1.000.800.600.400.200.00BSA質(zhì)量(ug)04080120160200（2） 取試劑A15.00ml,試劑B0.75ml,試劑C0.75ml,在50ml三角瓶中混勻，在每支試管中分別準(zhǔn)確加入此試劑1.00ml，充分搖勻，靜置15min。（3） 分別在各試管中準(zhǔn)確加入Folin-酚試劑稀釋液3.00ml，立即震蕩，充分搖勻。（4） 靜置45min，在540nm波長下測定每個試管中也的吸光度（A值）。（5） 以A值為縱坐標(biāo)，BSA質(zhì)量（0?200ug）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2。樣品的測定將啤酒樣品適當(dāng)稀釋，吸取2份，各1.00ml，重復(fù)步驟（2）?（4）。編號空白1編號空白12345樣1樣2平均BSA(ug)04080120160200110.12吸光度0.0000.1330.2360.3430.4330.5450.3060.3310.318五、實驗記錄和數(shù)據(jù)處理0.6「0.5-0.4-0.3-0.2-0.1- A0 0 5當(dāng)Y=0.318時，x=113.57樣品中蛋白質(zhì)的含量（mg/ml）=XaXNX0.001=113.57X20X0.001=2.27六、說明1加入Folin-酚試劑后立即將反應(yīng)搖勻，以便Folin-酚試劑在堿溶液中破壞之前即能被銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物還原。短時間內(nèi)反應(yīng)液的顏色保持穩(wěn)定，因此，靜置45min后反應(yīng)立即測定吸光度，若拖延時間過長，顏色將會變化，影響結(jié)果。七、思考題1測定食品中蛋白質(zhì)含量的常用方法有哪些，其原理、適用性如何。答：（1）凱式定氮法原理：樣品中含氮有機化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化，含氮有機物分解產(chǎn)生氨氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨氨用過量的硼酸溶液吸收，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。適用性：凱氏定氮法適用范圍廣泛，測定結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜費時試劑消耗量大。凱氏定氮法是目前分析有機化合物含氮量常用的方法，是測定試樣中總有機氮最準(zhǔn)確和最簡單的方法之一，被國際國內(nèi)作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法。（2） Lowry-Folin法原理：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅鹽課產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，產(chǎn)生絡(luò)合物，此絡(luò)合物會將磷鉬酸-磷鎢酸（Folin）試劑還原，產(chǎn)生深藍色絡(luò)合物。在一定條件下，藍色深淺與蛋白質(zhì)的量成正比。在波長540nm處測定樣品的吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，可確定蛋白質(zhì)的含量。適用性：這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。（3） 紫外吸收法原理：蛋白質(zhì)分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。適用性：紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定，測定后仍能回收使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。（4） 考馬斯亮藍法（Bradford）原理：Bradford法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。考馬斯亮藍是一種有機染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基結(jié)合后變?yōu)樗{色，其最大吸收波長從465nm變?yōu)?9nm，蛋白質(zhì)在1-1000Mg范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)一色素結(jié)合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。適用性：考馬斯亮藍G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速而穩(wěn)定，2min左右即達到平衡，其結(jié)合物室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5?20min之間，顏色的穩(wěn)定性最好。該方法適用于要求靈敏度高、快速定量測定微量蛋白質(zhì)的測定。(5)雙縮月尿法(Biuret)原理：在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮尿反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能夠以1個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮尿反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。適用性：雙縮尿法中樣品的取用量對測定結(jié)果的準(zhǔn)確性有顯著影響，采用0.5g樣品，40mL雙縮尿試劑的比例具有較高的檢測精度。雙縮尿法對不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近不受溫度的影響?？煽焖贉y定蛋白質(zhì)含量，試劑單一，方法簡便，但靈敏度差，測定范圍為1?20mg蛋白質(zhì)。適用于需要快速但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定，常用于谷物