DB32T 3762.21-2023新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范 第21部分：污水樣本病毒富集濃縮和檢測

ICS13.100CCSC50江蘇省地方標準DB32/T3762.21—2023新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范第21部分：污水樣本病毒富集濃縮和檢測SARS?CoV?2detection—Part21：Concentrationanddetectionofvirusinsewagesamples2023-07-25發(fā)布2023-08-25實施江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布ⅠDB32/T3762.21—2023前言 1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 14檢出限與回收率 15環(huán)境與設施 16設備與耗材 27試劑與材料 28污水樣本富集濃縮 29核酸檢測 310標準曲線的建立 311污水新冠病毒濃度定量 312回收率計算 313質量控制 414結果與報告 4ⅢDB32/T3762.21—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB32/T3762《新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范》的第21部分。DB32/T3762已經發(fā)布了以下部分：——第1部分：生物樣本采集、運輸和保存；——第2部分：病毒分離與鑒定；——第3部分：核酸熒光PCR檢測程序；——第4部分：重組酶介導等溫擴增程序；——第5部分：血清IgM和IgG抗體酶聯免疫吸附檢測程序；——第6部分：血清IgM和IgG抗體膠體金免疫層析檢測程序；——第7部分：空氣樣本檢測與評估；——第8部分：物體表面檢測與評估；——第9部分：醫(yī)務人員職業(yè)暴露檢測與評估；——第10部分：微量血清中和試驗；——第11部分：全基因組高通量測序；——第12部分：藥物體外抗病毒效果測定；——第13部分：疊氮溴化丙錠-熒光PCR檢測程序；——第14部分：N亞基因組熒光PCR檢測程序；——第15部分：血清/血漿IgM和IgG抗體磁微?；瘜W發(fā)光法檢測程序；——第16部分：核酸數字PCR法；——第17部分：核酸檢測用假病毒陽性質控品；——第18部分：規(guī)?；怂釞z測程序；——第19部分：全自動核酸快速一體化檢測；——第20部分：核酸熒光PCR檢測質量控制；——第21部分：污水樣本病毒富集濃縮和檢測。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由江蘇省衛(wèi)生標準化技術委員會提出并歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預防控制中心、北京大學分子工程蘇南研究院、蘇州市疾病預防控制中心、無錫市疾病預防控制中心、揚州市疾病預防控制中心、常熟市疾病預防控制中心、未名環(huán)境分子診斷（常熟）有限公司、南京醫(yī)科大學。1DB32/T3762.21—2023新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范第21部分：污水樣本病毒富集濃縮和檢測本文件規(guī)定了污水樣本中新型冠狀病毒富集濃縮和檢測方法。本文件適用于生活、醫(yī)療、商業(yè)和工業(yè)等污水樣本中的新型冠狀病毒的濃縮富集和檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求WS/T799—2022污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測方法標準3術語和定義以下術語和定義適用于本文件。裂解法pyrolysismethod利用裂解鹽使污水中病毒核酸與蛋白分離，高鹽條件下的污水通過濾膜，其核酸樣本被膜吸附，完成富集過程，利用低鹽條件將吸附的核酸樣本從膜上洗脫，再進行后續(xù)檢測分析。濃縮富集后回收樣本的總拷貝數與原污水樣品中接種的病毒總拷貝數之比。4檢出限與回收率富集濃縮采用裂解法時，方法的檢出限為1copy/mL，N靶標的回收率為16%~65%，ORF1ab靶標的回收率為10%~48%。5環(huán)境與設施富集濃縮和檢測等操作應在生物安全二級實驗室（BSL?2）進行，同時采用不低于生物安全三級實驗室的個人防護。實驗過程中產生的所有廢棄物（包括剩余水樣）均應經有效滅菌后再按醫(yī)療廢棄物進行分類處理。新冠病毒核酸檢測實驗室應滿足GB19489。2DB32/T3762.21—20236設備與耗材計（精度≥0.01）、水浴鍋、多孔真空抽濾裝置、滾軸搖勻儀、電子天平（分辨力不低于0.001g）、實時熒光定量PCR儀或數字PCR儀。N95及以上防護口罩、醫(yī)用無紡布帽、護目鏡、連體防護服、一次性PE手套、一次性手術衣、乳膠手7試劑與材料100mmol/LEDTA配制方法：稱取12.11g三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度≥99%3.36g乙二胺四乙酸二鈉（純度≥99%置于燒杯中，加入70mL水，攪拌溶解后轉移至試劑瓶中，用鹽酸將pH調至7.2，定容至100mL）。注：其他材料參照所用病毒核酸提取、擴增試劑盒。8污水樣本富集濃縮8.1樣本滅活樣本滅活按照WS/T799—2022中第6章執(zhí)行。用大容量電動移液器移取40mL滅活后的污水樣本于50mL無菌離心管中，加入9.35gNaCl和400μLTE緩沖液，使用滾軸搖勻儀震蕩混合，直至NaCl固體完全溶解。多孔真空抽濾裝置上依次接1μm玻璃纖維膜和50mL注射器套管，無菌錐形瓶放置于真空抽濾裝置內對應位置。打開真空泵，在負壓條件下將上述樣品過濾收集到無菌錐形瓶中。關掉真空泵，打開閥門釋放壓力，取出錐形瓶，在濾液中加入40mL70%乙醇，振蕩搖勻，室溫靜置5min。注：未配備多孔真空抽濾裝置的實驗室可使用常規(guī)固相萃取裝置代替，完成預過濾和富集濃縮步驟；未配備滾軸搖勻儀的實驗室可手動搖勻，促進NaCl固體的溶解。3DB32/T3762.21—20238.3富集濃縮多孔真空抽濾裝置上依次連接核酸富集柱、增量管。打開真空泵，形成負壓。將濾液與乙醇混合樣混勻后，倒入增量管中，通過核酸富集柱完成濃縮步驟。注：如污水樣品較為渾濁，過濾速度慢或發(fā)生堵塞，可使用新的核酸富集柱進行替換，完成富集過程，同一污水樣本所有的核酸富集柱的洗脫液作為該污水樣本的濃縮液。待樣品濃縮完成后，關掉真空泵，打開閥門釋放壓力，回收核酸富集柱。核酸富集柱置入配套離心管中，將無核酸酶水加入到柱膜中間，靜置3min~5min后，4℃條件下12000r/min離心1min，收集洗脫液，最終獲得的洗脫液即為該污水樣本的濃縮液。后續(xù)可依據病毒核酸提取試劑盒說明完成提取步驟。注：依據病毒核酸提取試劑盒所加入樣本量體積，確定加入核酸富集柱無核酸酶水體積，兩者體積可保持一致。洗脫的濃縮液為原始核酸樣本，如果當天能完成提取和擴增步驟時，濃縮液4℃保存；或冷凍在-80℃以備日后檢測。9核酸檢測富集濃縮后樣本的新冠病毒核酸檢測按照WS/T799—2022中第8章執(zhí)行。10標準曲線的建立污水中病毒核酸的濃度需通過標準曲線進行換算。建立標準曲線的樣本應與目標實驗的樣本匹配，即相同的總RNA樣本。標準曲線分析的稀釋范圍或動態(tài)范圍應涵蓋實驗樣本預期的濃度范圍。本文件中可選用新冠病毒核酸基因組標準物質制備標準曲線。將已知病毒核酸濃度的樣本進行連續(xù)10倍或5倍梯度稀釋，設置至少6個濃度梯度，每個濃度至少做3個樣本平行，2個擴增平行。以已知的連續(xù)稀釋濃度的對數值為橫坐標，該濃度對應的Ct值為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線應滿足R2≥0.99，擴增效率在90%~110%之間。11污水新冠病毒濃度定量當污水樣品判定為新冠核酸陽性后，可使用數字PCR儀完成上機前核酸樣本濃度CS的絕對定量；如使用實時熒光定量PCR儀檢測，可使用標準曲線完成定量工作。濃縮處理前污水體積為VSmL，富集后濃縮液體積為VCμL，從濃縮液中取出VEμL進行核酸提取，得到的核酸體積為VNμL，對該核酸樣本進行RT?qPCR分析，通過建立標準曲線，將樣本檢出Ct值代入標準曲線公式，換算為提取后的核酸濃度CS（copies/μL污水中新冠病毒濃度CWW（copies/mL）按公式（1）計算：CWW=…………（1）注：由于方法回收率受個體操作、污水基質、病毒濃度和試劑盒眾多因素影響，在實際操作過程中，難以實現每份污水樣本的方法回收率數據的收集，故在此計算過程中忽略方法回收率的影響。12回收率計算將已知濃度的新冠病毒假病毒加入到40mL污水中，混合搖勻。后續(xù)步驟與污水樣本檢測操作保持一致，完成富集濃縮、提取和擴增步驟，以該樣本的Ct值換算污水中新冠病毒濃度CWW（單位為copies/mL濃4DB32/T3762.21—2023縮處理前污水體積為VSmL（40mL根據接種假病毒濃度C0（copies/mL）和接種假病毒體積V0mL，污水濃縮富集過程的回收率R（%按公