納米金在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用

納米金在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用

納米技術(shù)是在納米空間（0.1nm）上研究電子、原子、分子或原子團(tuán)和分子的綜合技術(shù)。它已深入每個(gè)領(lǐng)域，成為世界研究的熱點(diǎn)。納米材料是指基本單元的顆?；蚓Я３叽缰辽僭谝痪S以上小于100nm的材料。它具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)。這四種效應(yīng)是納米粒子、納米固體材料的基本特性,也是納米材料的性能與常規(guī)材料有很大差異的原因,而且這些效應(yīng)使得納米材料呈現(xiàn)優(yōu)良的光學(xué)、電學(xué)性質(zhì)和良好的生物親合性。納米材料所具有的表面效應(yīng)和體積效應(yīng),使其與其它原子結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出很高的化學(xué)活性,很容易與外界原子結(jié)合,而使納米粒子的比表面積、表面能及表面結(jié)合能都迅速增大。另外,納米粒子具有良好的生物相容性,能提供一個(gè)類似生物分子本體環(huán)境的微環(huán)境,可以很好地保持生物組分的活性,因此納米粒子非常適合用于構(gòu)制性能良好的電化學(xué)生物傳感器。納米微粒的高活性特異性、極微小性等特點(diǎn)與生物傳感器所要求的多功能、微型化、高速化相對(duì)應(yīng),將納米材料引入到電化學(xué)傳感器中的研究中,取得許多創(chuàng)新性研究成果。本文綜述了1995～2007年間,納米金、碳納米管和納米線三種納米材料在電化學(xué)生物傳感器研究中的新進(jìn)展。1納米金納米粒子作為生物傳感器的應(yīng)用納米金是研究最早、在電化學(xué)生物傳感器中應(yīng)用最廣泛的納米顆粒之一。納米金在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用包括以下幾個(gè)方面:1.1納米金作為電活性標(biāo)記物金納米顆粒除具有表面效應(yīng)外,還具有良好的導(dǎo)電性能,因而比非金屬納米顆粒的增強(qiáng)作用更為顯著,通常用于標(biāo)記生物分子的納米顆粒主要是納米金。其所以如此,主要由于金納米顆粒能與巰基之間發(fā)生強(qiáng)的共價(jià)鍵合,從而使膠體金與巰基標(biāo)記的生物活性分子可結(jié)合形成探針,易用于生物體系的檢測(cè)。關(guān)于膠體金在各種生物傳感器中的信號(hào)放大作用的文獻(xiàn)報(bào)道很多。其中,一種非常成功的方法是將納米技術(shù)、核酸雜交技術(shù)和電化學(xué)分析技術(shù)三項(xiàng)技術(shù)在電極表面相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的高靈敏檢測(cè)。例如,Wang和Authier都報(bào)道了將納米金顆粒接在寡核苷酸的末端作為電活性標(biāo)記物,雜交完成后,在強(qiáng)酸的作用下使金納米粒子溶解釋放出大量的Au(Ⅲ)離子,用陽(yáng)極溶出伏安法或電位溶出法測(cè)定Au(Ⅲ)的響應(yīng)信號(hào)從而間接測(cè)定DNA的含量。Ozsoz等以納米金作為電活性標(biāo)記物,先在納米金表面修飾半胱胺,然后用EDC和NHS活化偶聯(lián)Factor-V寡聚核苷酸片段以制備電活性DNA探針,與固定在筆式電極上的互補(bǔ)DNA雜交,制備了重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好的電化學(xué)DNA傳感器,檢出限達(dá)0.78fmol。Cai等將納米金標(biāo)記在巰基修飾寡核苷酸末端,然后將金標(biāo)記的DNA捕獲到電極表面,并結(jié)合免疫分析中的“金標(biāo)銀染”技術(shù)完成對(duì)特定序列的DNA互補(bǔ)鏈的識(shí)別以及對(duì)DNA鏈中的堿基突變的電化學(xué)檢測(cè)。Wang等將抗生蛋白鏈霉素固定于磁性納米粒子上用來(lái)固定生物素修飾的DNA探針,利用電化學(xué)方法檢測(cè)納米金標(biāo)記的DNA。胡勁波等用帶有二茂鐵的納米金微粒/抗生蛋白鏈菌素結(jié)合物為標(biāo)記物,將其標(biāo)記于生物素修飾的寡聚核苷酸片段上,制成了具有電化學(xué)活性和納米金放大作用的DNA電化學(xué)生物傳感器。通過(guò)伏安法測(cè)定了修飾在納米金上的二茂鐵的氧化還原電流,從而識(shí)別和測(cè)定溶液中互補(bǔ)的靶點(diǎn)DNA,檢出限達(dá)7.5×10-13mol/L。Fang等合成了一種新的Cu/Au核殼型納米粒子,并將其應(yīng)用于大腸桿菌毒素基因分析。他們用低溫法制備了一種以Cu為核,Au薄層為殼的核殼型納米粒子,使之易于和ssDNA進(jìn)行功能性聚合,這種核殼型Cu/Au納米粒子與有5’-巰基修飾的ssDNA偶聯(lián),制備成納米標(biāo)記的DNA探針,待測(cè)ssDNA固定在玻碳電極表面,當(dāng)它與相對(duì)應(yīng)的Cu/Au核殼納米粒子標(biāo)記DNA探針雜交后形成含有納米標(biāo)記物的DNA雜交分子,用酸將標(biāo)記物中的納米粒子溶解后使用高靈敏的陽(yáng)極溶出伏安法進(jìn)行測(cè)定,對(duì)大腸肝菌毒素DNA的檢出限為5.0pmol/L。Fang的研究小組還結(jié)合核酸適體技術(shù)和納米技術(shù),構(gòu)建以凝血酶蛋白為研究對(duì)象的高效、高靈敏、特異性識(shí)別蛋白質(zhì)的適體電化學(xué)生物傳感器。他們利用金納米顆粒標(biāo)記的核酸適體以及被固定在磁性納米顆粒上的核酸適體與凝血酶蛋白同時(shí)結(jié)合形成磁性顆粒/凝血酶/納米金膠的三明治結(jié)構(gòu),利用磁性分離,將金膠納米顆粒特異性地吸著到電極表面,通過(guò)檢測(cè)電極上金膠的電化學(xué)信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶靶蛋白的檢測(cè)。檢測(cè)凝血酶蛋白質(zhì)的線性范圍為5.6×10-12mol/L～1.12×10-9mol/L,檢出限為1.4×10-12mol/L。這些研究都屬于DNA分析的前沿課題。1.2納米金用于構(gòu)制電化學(xué)生物傳感器的活性界面在生物傳感器的制作中,生物活性分子的固定化技術(shù)直接關(guān)系到生物傳感器的重現(xiàn)性、靈敏度、壽命等性能。利用納米粒子作為固定生物分子的載體以構(gòu)制生物傳感器的活性界面,可以制備性能良好的生物傳感器,這一方面是由于納米粒子具有良好的生物相容性,能提供一個(gè)類似生物分子本體環(huán)境的微環(huán)境,可以有效保持生物材料的活性;另一方面,表面效應(yīng)是納米顆粒最重要的效應(yīng)之一,納米顆粒的表面效應(yīng)使其具有很高的表面吸附能力,是固定生物材料合適的媒介,同時(shí)納米粒子可與生物分子的某些特定基團(tuán)定向結(jié)合,使固定的生物分子達(dá)到定向排列、取向規(guī)則的目的,從而能夠進(jìn)一步提高生物分子的活性,近年來(lái)有不少報(bào)道利用納米材料作為固定生物材料的媒介以構(gòu)制生物傳感器的活性界面,為電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展開(kāi)辟了新途徑。例如,RetnaRaj等將半胱胺自組裝于金電極上,再利用半胱胺的末端氨基自組裝納米金,該修飾電極對(duì)多巴胺的電化學(xué)氧化有顯著的催化作用,檢出限為0.13umol/L,并能有效地排除抗壞血酸的干擾。Xiao等將HRP自組裝到納米金/半胱胺修飾的金電極上構(gòu)制了第三代的HRP生物傳感器。Liu等將葡萄糖氧化酶固定在納米金修飾的碳糊電極表面構(gòu)制了不需要電子媒介的葡萄糖傳感器,還將納米金分散摻雜到包埋酪氨酸酶的碳糊電極中,制備了無(wú)需電子介體的性能良好的酚類傳感器,并對(duì)納米金明顯提高傳感器性能的原因進(jìn)行分析,認(rèn)為:納米金在體系中起著提高酶的生物活性,使酶更容易接近底物分子的作用。Ju等通過(guò)將HRP固定在納米金修飾的碳糊電極表面構(gòu)制了電極表面可更新的HRP生物傳感器。唐芳瓊等通過(guò)使用納米憎水Au、親水Au、憎水SiO2顆粒與聚乙烯醇縮丁醛混合構(gòu)成復(fù)合固酶膜基質(zhì),用溶膠-凝膠法固定葡萄糖氧化酶,從而構(gòu)制了納米顆粒增強(qiáng)的葡萄糖生物傳感器,實(shí)驗(yàn)表明,納米金可以大幅度地提高固定化酶的催化活性,增大響應(yīng)電流。Chen等在Au電極表面修飾一層半胱胺,它可以共價(jià)結(jié)合戊二醛,通過(guò)戊二醛,再結(jié)合一層半胱胺,半胱胺的巰基用于固定納米Au,形成納米Au活性界面,用此活性界面固定HRP,制成H2O2傳感器,研究結(jié)果表明:固定在納米金Au上的HRP活性得到有效保持,對(duì)H2O2有很強(qiáng)的催化能力。以上研究說(shuō)明,以納米材料為載體固定酶時(shí)具有比表面積大、表面反應(yīng)活性高、表面活性中心多、催化效率高、吸附能力強(qiáng)等特點(diǎn),使其逐漸成為固定化載體中最熱門的研究對(duì)象之一。納米金也被用于免疫傳感器的制作中,王存嫦等利用等離子體聚合膜沉積技術(shù)和納米金自組裝技術(shù)設(shè)計(jì)傳感器界面,在石英晶振表面上沉積正丁胺等離子體聚合膜,然后用戊二醛交聯(lián)結(jié)合半胱胺,在半胱胺膜上組裝納米金單層膜,得到可用于固定IgM抗體的壓電免疫傳感器。結(jié)果表明,以納米金單層作界面固定抗體時(shí),具有傳感界面不需活化、固定抗體的活性高、檢測(cè)時(shí)的非特異性吸附小、傳感器能反復(fù)再生等優(yōu)點(diǎn)。Ou等通過(guò)層層自組裝技術(shù)構(gòu)建了基于納米金/碳納米管/硫堇自組裝多層膜的新型電流型癌胚抗原免疫傳感器。他們借助硫堇膜上富含的氨基基團(tuán)實(shí)現(xiàn)對(duì)碳納米管與納米金顆粒二元納米復(fù)合材料的化學(xué)組裝,制備穩(wěn)定的納米金/碳納米管/硫堇/殼聚糖傳感界面,以此傳感界面固定免疫活性物質(zhì),從而制得高靈敏、高穩(wěn)定的電流型癌胚抗原(CEA)免疫傳感器。通過(guò)循環(huán)伏安法考察了電極表面的電化學(xué)特性,并對(duì)該免疫傳感器的性能進(jìn)行了詳細(xì)的研究,該傳感器對(duì)CEA檢測(cè)的線性范圍為0.5ng/mL～15.0ng/mL和15.0ng/mL～200.0ng/mL,檢出限為0.01ng/mL。1.3納米金用于研究蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移眾所周知,氧化還原蛋白質(zhì)/酶很難實(shí)現(xiàn)在裸露的金屬電極上直接發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。因而,近年來(lái)電化學(xué)工作者非常關(guān)注氧化還原蛋白質(zhì)/酶的直接電化學(xué)研究,而構(gòu)筑無(wú)需電子介體的電化學(xué)生物傳感器成為研究的熱點(diǎn)。Naton等首先報(bào)道了細(xì)胞色素C在納米金溶膠修飾二氧化錫電極表面上的直接電子傳遞。他們將金膠自組裝在SnO2電極上,并用金膠吸附細(xì)胞色素C,然后進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,出現(xiàn)了對(duì)稱的氧化還原峰,通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)為細(xì)胞色素C在電極表面的直接電子傳遞。Jia等在金電極表面修飾含巰基的溶膠-凝膠膜,再將納米金自組裝到巰基上,最后將HRP固定到納米金表面,由此固定的HRP可直接電化學(xué)檢測(cè)H2O2,構(gòu)建無(wú)需電子媒介的第三代H2O2生物傳感器。研究表明,固定在納米金上的HRP的活性得到有效的保護(hù),納米金與HRP作用,縮短了酶活性中心與電極表面的距離,從而實(shí)現(xiàn)了其直接電子傳遞,并且納米金的導(dǎo)電通道也有助于蛋白質(zhì)與電極表面之間的直接電子轉(zhuǎn)移。這方面的工作還有Bharathi和陳洪淵的研究小組都報(bào)道了采用膠體金實(shí)現(xiàn)血紅蛋白在電極表面的直接電化學(xué)。2碳納米管傳感器碳納米管是一種特殊結(jié)構(gòu)的一維量子材料,它的徑向尺寸為納米級(jí),軸向尺寸為微米級(jí),主要由呈六邊形排列的碳原子構(gòu)成數(shù)層到數(shù)十層的同軸圓管,相鄰的同軸圓柱面之間的間距與石墨層間距相當(dāng),約為0.34nm。根據(jù)管臂中碳原子的層數(shù)可分為單臂碳納米管(SWNT)和多臂碳納米管(MWNT)。碳納米管的管壁中存在有大量的拓樸學(xué)缺陷,比其它的石墨變體有更大的反應(yīng)活性;由于碳納米管壁的彎曲,使電荷在其中的傳輸比石墨更快,在化學(xué)反應(yīng)中用作電極時(shí),呈現(xiàn)出更大的電荷傳遞速率。碳納米管兼具有金屬性和半導(dǎo)體性,導(dǎo)電性很強(qiáng),并且具有大的比表面積和優(yōu)良的電催化性能,是優(yōu)越的電子傳遞媒介,能促進(jìn)電活性物質(zhì)的電子傳遞過(guò)程。另外,碳納米管具有較好的柔韌性,很強(qiáng)的抗壓能力,因此碳納米管作為電極材料和電活性材料在構(gòu)筑電化學(xué)生物傳感器方面具備了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Azamian等將葡萄糖氧化酶固定在SWNT表面,仍能很好地保持酶的活性,經(jīng)過(guò)比較研究發(fā)現(xiàn),酶的催化活性比普通碳電極固定的酶的催化活性提高1個(gè)數(shù)量級(jí),這是由于碳納米管特殊的中空管狀結(jié)構(gòu)使之具有較大的比表面積,因而將碳納米管用于酶分子的固定可以增加固定的酶分子數(shù)從而增強(qiáng)反應(yīng)信號(hào),同時(shí)碳納米管對(duì)酶活性中心的電子傳遞具有促進(jìn)作用,能夠提高酶分子的相對(duì)活性。Wang等用多臂碳納米管固定葡萄糖氧化酶來(lái)測(cè)定葡萄糖,傳感器的響應(yīng)時(shí)間短,靈敏度和穩(wěn)定性也得到了提高。近年來(lái),碳納米管也被用于多巴胺和NADH等生物傳感器的構(gòu)置。根據(jù)碳納米管本身的催化和增敏效應(yīng),使得基于碳納米管的電化學(xué)生物傳感器具有廣闊的應(yīng)用前景。在傳感器的制作技術(shù)上,改變了以前無(wú)序地把碳納米管固定在電極表面的做法,構(gòu)置陣列型有序的碳納米管傳感器漸漸地成為了研究的重點(diǎn)。Lin等在電極表面定向生長(zhǎng)SWNT超微電極陣列,由于電極與電極之間的距離大于擴(kuò)散層的半徑,所得電極具有超微電極的性質(zhì)。SWNT管端的羧基用EDC和NHS活化,通過(guò)形成酰胺鍵偶聯(lián)結(jié)合GOD,傳感器的響應(yīng)時(shí)間為20s～30s,檢出限為8×10-5mol/L。Ye等合成了有序排列的多臂碳納米管束(well-alignedMWNTs)修飾電極,利用碳納米管的電催化效應(yīng)不加任何酶直接對(duì)葡萄糖進(jìn)行測(cè)定,與一般玻碳電極相比產(chǎn)生了400mV的電位降。J.I.Yeh等將碳納米管陣列電極的末端羧基用EDC和NHS活化,用于組裝NADH氧化酶和功能化的金納米顆粒,制成了高靈敏檢測(cè)NADH的傳感器。由于快速、簡(jiǎn)單、低成本檢測(cè)基因和傳染性疾病研究的需要,基于核酸識(shí)別過(guò)程的電化學(xué)DNA生物傳感器近年來(lái)得到迅速地發(fā)展,而碳納米管在DNA電化學(xué)傳感器中也有廣泛應(yīng)用,Wang等成功地將CdS標(biāo)記在碳納米管增強(qiáng)的DNA探針上,研制成了檢出限達(dá)到pg級(jí)的DNA傳感器。Wang等還報(bào)道了一種利用碳納米管超靈敏檢測(cè)目標(biāo)DNA和抗原的分析方法,其方法原理是基于酶標(biāo)記物來(lái)放大檢測(cè)DNA或抗原蛋白的信號(hào)。碳納米管在體系中具有雙重作用:一是大量的固定酶標(biāo)記物起年個(gè)到的放大作用;二是利用碳納米管換能器的富集特性放大酶促反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)信號(hào)。Rivas利用多壁碳納米管糊電極(CNTPE)研究了鳥(niǎo)嘌呤堿基對(duì)在電極上的吸附固定和電化學(xué)氧化。結(jié)果表明:與玻碳電極、碳糊電極和石墨電極相比,CNTPE電極能極大地提高鳥(niǎo)嘌呤的氧化信號(hào),并且利用此結(jié)果制備了無(wú)標(biāo)記DNA雜交傳感器,并用于通過(guò)短時(shí)間富集檢測(cè)痕量(μg/L)核酸。Johnston等利用碳納米管制備的DNA生物傳感器可以達(dá)到6amol的檢測(cè)限。Gang等通過(guò)分析CNT與DNA的相互作用獲得了DNA的序列信息。碳納米管由于具有良好的內(nèi)在導(dǎo)電性,又能保持蛋白質(zhì)和酶的生物活性,因而在蛋白質(zhì)直接電子轉(zhuǎn)移的研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。Davis等以碳納米管糊作為電極材料研究了細(xì)胞色素C和銅綠假單胞菌的電子轉(zhuǎn)移響應(yīng)。Yan等研究了血紅素蛋白質(zhì)如HRP、Hb、Mb、Cytc在碳納米管上的電化學(xué)及電催化行為,為構(gòu)建第三代H2O2生物傳感器奠定了基礎(chǔ)。Zhao等將HRP吸附在CNT上,制作成CNT微電極,在此基礎(chǔ)上構(gòu)置MWNT修飾的第三代HRP生物傳感器,并研究了HRP在電極上的直接電化學(xué)。李南強(qiáng)等研究了細(xì)胞色素C在SWNT修飾電極上的直接電化學(xué),在濃度范圍3.0×10-5～7.0×10-4mol/L內(nèi),峰電流和細(xì)胞色素C的濃度成正比,檢出限為1.0×10-5mol/L。Chen等研究了細(xì)胞色素C在DNA/MWNT修飾電極上的直接電化學(xué)。Cai等和Zhao等分別報(bào)道了血紅蛋白和肌紅蛋白在碳納米管修飾電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。電子的直接轉(zhuǎn)移使得這兩種蛋白構(gòu)成的修飾電極對(duì)H2O2和NO產(chǎn)生明顯的催化作用。這些現(xiàn)象的產(chǎn)生原因一方面是由于碳納米管的表面缺陷導(dǎo)致了較高的表面活性,有利于酶和碳管之間的電子傳遞,另一方面是由于碳納米管起到分子導(dǎo)線的作用,將電子傳遞到酶的氧化還原活性中心所致。JustinGooding等把微過(guò)氧化物酶microperoxidaseMP-11固定在有序排列的SWNT末端,以SWNT作為分子導(dǎo)線加速電子傳遞過(guò)程,實(shí)現(xiàn)了該氧化還原蛋白質(zhì)在金電極上的直接電子轉(zhuǎn)移。這些研究都體現(xiàn)了碳納米管對(duì)生物分子的電催化作用,顯示了其作為生物傳感器的應(yīng)用潛能。3基于納米線的電化學(xué)測(cè)量準(zhǔn)一維實(shí)心的納米材料是指在兩維方向上為納米尺度,長(zhǎng)度比上述兩維方向上的尺寸大得多的新型納米材料。其中縱、橫比小的稱作納米棒,縱、橫比大的稱作納米線。一般情況下,長(zhǎng)度大于1μm的稱為納米絲或納米線。作為納米材料的成員之一,納米線因其優(yōu)越的光學(xué)性能、電學(xué)性能以及力學(xué)性能等特性而引起物理界、化學(xué)界及材料界科學(xué)家們的普遍關(guān)注,近年來(lái)成為納米技術(shù)研究的熱點(diǎn)。納米線遠(yuǎn)不如前述的納米金粒子和碳納米管在電化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛。這主要的原因是制備過(guò)程中模板的選擇比較困難。盡管如此,電分析工作者仍