原生質(zhì)體融合與體細(xì)胞雜交（植物組織培養(yǎng)課件）

原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交

植物組織培養(yǎng)技術(shù)教學(xué)終極目標(biāo)

掌握原生質(zhì)體培養(yǎng)1.了解原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交的意義2.掌握原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交的基本過程和主要方法促成目標(biāo)教學(xué)目標(biāo)工作任務(wù)原生質(zhì)體的培養(yǎng)及活力鑒定任務(wù)3對向日葵下胚軸和子葉的原生質(zhì)游離任務(wù)1原生質(zhì)體融合及融合體的培養(yǎng)

任務(wù)4融合體的選擇及雜種細(xì)胞進(jìn)行鑒定

任務(wù)5

對獲得的原生質(zhì)體純化任務(wù)2微絲葉綠體線粒體質(zhì)膜細(xì)胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微管細(xì)胞壁高爾基體植物細(xì)胞模式圖液泡項目介紹原生質(zhì)體含義：

去掉細(xì)胞壁的由質(zhì)膜包裹、具有生活力的裸露細(xì)胞。它在培養(yǎng)條件下①具有再生細(xì)胞壁，進(jìn)行連續(xù)的細(xì)胞分裂并再生成完整植株的能力；②具有攝取外源大分子、細(xì)胞器，以及細(xì)菌，病毒的能力，因此是進(jìn)行遺傳操作，基因轉(zhuǎn)移的好材料；③通過同種和異種植物的原生質(zhì)體融合，可產(chǎn)生異核體，實現(xiàn)體細(xì)胞雜交，培育出新品種。原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義

植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合是植物細(xì)胞工程的核心技術(shù)，尤其在克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性、創(chuàng)造種質(zhì)資源方面發(fā)揮了重要作用；

植物原生質(zhì)體比較容易攝取外來遺傳物質(zhì)，是遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體，為細(xì)胞水平、分子水平上的遺傳操作提供了理想的實驗體系；為細(xì)胞生物學(xué)、植物生理學(xué)和體細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交

——原生質(zhì)分離培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)技術(shù)工作任務(wù)原生質(zhì)體的培養(yǎng)及活力鑒定任務(wù)3對向日葵下胚軸和子葉的原生質(zhì)游離任務(wù)1原生質(zhì)體融合及融合體的培養(yǎng)

任務(wù)4融合體的選擇及雜種細(xì)胞進(jìn)行鑒定

任務(wù)5

對獲得的原生質(zhì)體純化任務(wù)2原生質(zhì)體存活率測定原生質(zhì)體純化原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體融合融合體培養(yǎng)原生質(zhì)體分離融合體的選擇雜種細(xì)胞鑒定原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交基本流程及常用方法實踐知識一、向日葵下胚軸和子葉的原生質(zhì)體分離（酶解法）

（一）無菌苗培育

選取仔粒飽滿日葵種子去殼后,消毒將消毒的種子接種于不含任何激素的MS固體培養(yǎng)基上。置于暗處發(fā)芽,溫度為(26±1)℃。（二）酶液的配制

酶液Ⅰ組成：纖維素酶酶液Ⅱ組成：纖維素酶（三）原生質(zhì)體分離(一步分離法)

取前面培育的無菌苗，用刀片切下下胚軸后撕去表皮，縱剖若干細(xì)條，再橫切成2～3mm小段放入酶液Ⅰ中。撕去葉片的小表皮，切成小塊放入酶液Ⅱ中。每10mL酶液中約放2g材料，在26℃下酶解3～4h，其間搖動幾次。

（四）向日葵下胚軸原生質(zhì)體的純化（漂浮法）漂浮法：是指應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂浮于液體表面，來進(jìn)行原生質(zhì)體純化的方法。

向日葵下胚軸原生質(zhì)體的純化具體方法步驟如下：

1.將酶解后的向日葵下胚軸原生質(zhì)體用200目不繡鋼網(wǎng)過濾，除去未解離的組織，再用22%的蔗糖溶液沖洗網(wǎng)上殘渣（蔗糖溶液體積與酶液相等）。

2.濾液（即酶液和蔗糖液）裝入離心管，以600r/min離心3～6min。

3.待原生質(zhì)體漂浮后吸去下面的液體及殘渣。4.加入17%蔗糖溶液6～8ml，混勻后離心（600r/min，5分鐘），吸去下面的液體及殘渣，重復(fù)一次。5.加入1～2ml0.16mol/LCaCl2?2H2O（加1%MES，pH=5.8），使原生質(zhì)體的密度在2103g/ml條件下懸浮，以備后面進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合之用。

（五）向日葵子葉原生質(zhì)體的純化（界面法）界面法：是指選用兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液的密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液密度小于原生質(zhì)體的密度，原生質(zhì)體即介于兩種溶液之間，從而對原生質(zhì)體進(jìn)行純化的方法。

原生質(zhì)體分離及純化

一、原生質(zhì)體分離雙子葉外植體胚性細(xì)胞（一）材料來源多數(shù)植物分離原生質(zhì)體的經(jīng)典材料-----葉肉細(xì)胞。問題探究

禾本科植物：愈傷組織或懸浮細(xì)胞。供體材料的重要性

供體材料是影響原生質(zhì)體培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。理論上植物的各種器官、組織和細(xì)胞都可作為分離原生質(zhì)體的供體材料，但目前常用葉片、分裂旺盛和再生能力強的愈傷組織及懸浮細(xì)胞系，尤其是胚性愈傷組織或胚性懸浮細(xì)胞系是最理想的原生質(zhì)體分離材料。（二）分離方法機械分離法酶法分離法最初用的是機械分離的辦法，但是效率極低。英國科學(xué)家Cocking于1960年利用酶.降解去細(xì)胞壁的辦法從番茄根尖分離了大量的原生質(zhì)體，成為現(xiàn)在廣泛使用的方法。首先對外植體進(jìn)行預(yù)處理有兩種方法：低溫處理：外植體放在4℃下，黑暗中1-2天。等滲溶液處理：外植體放在等滲溶液中數(shù)小時。1、機械分離法優(yōu)點：

（1）能排除酶的有害影響；

缺點：

（1）原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；

（2）方法繁瑣費力；

（3）液泡化程度低的細(xì)胞也不能采用,此方法局限性大步驟：使細(xì)胞質(zhì)壁分離→切開細(xì)胞壁→獲得原生質(zhì)體。（1）確定酶的種類纖維素酶類（Cellulase）果膠酶類（Pectolyase）半纖維素酶類（Hemicellulase）崩潰酶蝸牛酶2、酶法分離（Enzymaticisolation）

植物細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的構(gòu)成：細(xì)胞膜：脂類、蛋白質(zhì)細(xì)胞壁：初生壁（纖維素、半纖維素、果膠、量結(jié)構(gòu)蛋白）、次生壁（纖維素、半纖維素）兩個相鄰細(xì)胞的初生壁之間有胞間層。（2）酶液的配制酶的配比及濃度滲透壓穩(wěn)定劑及pH（3）分離原生質(zhì)體一步法：外植體放入酶液，真空泵抽引滲透處理、26℃搖床振蕩2-8小時方法有二：

葉肉原生質(zhì)體分離提純兩步分離法一步分離法兩步法：果膠酶處理材料、游離出單細(xì)胞、纖維素酶處理單細(xì)胞、分離出原生質(zhì)體優(yōu)點：所獲得的原生質(zhì)體均勻一致、質(zhì)量好；缺點：操作復(fù)雜，已被淘汰。圖示一步法原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）過濾、離心加果膠酶和纖維素酶原生質(zhì)體純化與活力測定（一）原生質(zhì)體純化方法三種離心沉淀法漂浮法界面法

純化原因：上述酶處理后的混合物含有：未消化組織、破碎細(xì)胞和原生質(zhì)體。所以，必須對得到的混合液體進(jìn)行純化，以得到純凈的原生質(zhì)體。問題探究1、離心沉淀法

原理：應(yīng)用原生質(zhì)體的比重大于溶液，離心后原生質(zhì)體沉于底部。步驟：第一步原生質(zhì)體溶液用400目網(wǎng)篩過濾，除去未消化的組織細(xì)胞。第二步離心（500-1000r/min，離心5-6min）。第三步吸去上清液，洗滌液重新懸浮，再離心沉淀。如此2-3次。第四步用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗1次，收集原生質(zhì)體。沉降法的優(yōu)點：純化收集方便，原生質(zhì)體丟失少；目前被廣泛采用。缺點：原生質(zhì)體純度不高。2、漂浮法原理：應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂浮在液體的表面。步驟：第一步：400目網(wǎng)篩過濾。第二步：離心。第三步：吸去上清液，洗滌液重懸，離心沉淀。2-3次。第四步：收集溶液表面原生質(zhì)體，用培養(yǎng)液洗1次。漂浮法的優(yōu)點：原生質(zhì)體純度高。缺點：原生質(zhì)體收率低。3、界面法(不連續(xù)梯度法)

原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度。25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液

步驟離心管中配制成不同的濃度梯度加入原生質(zhì)體混合液離心5min，原生質(zhì)體位于某一濃度梯度，用吸管收集液體培養(yǎng)基。懸浮洗滌原生質(zhì)體2-3次將原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中備用優(yōu)點：獲得的原生質(zhì)體大小均勻一致，純度高；

缺點：操作繁瑣，原生質(zhì)體收率低。（二）原生質(zhì)體活力測定1、形態(tài)識別：形態(tài)上完整，呈圓形，含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)，顏色鮮艷的即為存活的原生質(zhì)體。2、染色識別

1）0.1%酚番紅或Evans藍(lán)染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。

2）雙醋酸鹽熒光素(FDA)染色法：在熒光顯微鏡下有熒光的即為有活性的原生質(zhì)體。影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素原生質(zhì)體活力原生質(zhì)體起始密度：過低過高均不利滲透壓穩(wěn)定劑：常用甘露醇培養(yǎng)基成分培養(yǎng)條件：初期培養(yǎng)是暗培養(yǎng)植物種類

原生質(zhì)體培養(yǎng)一、培養(yǎng)基pH滲透壓鈣鎂生長物質(zhì)氮源碳源培養(yǎng)基

（1）碳源

葡糖糖是最佳碳源，蔗糖單獨使用效果較差，與葡萄糖配合使用效果較好。碳源的作用一是保持細(xì)胞滲透壓，另一方面是作為細(xì)胞分裂時的能源物質(zhì)和組成原料。（2）氮源

適當(dāng)濃度的谷氨酰胺有利于原生質(zhì)體的的細(xì)胞再生、分裂、生長。NH4+濃度太高不利于原生質(zhì)體的培養(yǎng)，有毒害作用，在馬鈴薯上已有研究證明。（3）生長物質(zhì)

生長素和細(xì)胞分裂素是細(xì)胞分裂分化所需要的通常物質(zhì)，原生質(zhì)體培養(yǎng)也需要這些生長調(diào)劑。但不同植物對生長調(diào)節(jié)劑的濃度要求不同。（4）鈣鎂

研究指出在原生質(zhì)體培養(yǎng)中增加Ca2+的濃度。可增強原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，提高原生質(zhì)體的分裂能力率。明顯改變細(xì)胞內(nèi)外的離子交換。（5）滲透壓

最常用的滲透調(diào)節(jié)劑是山梨醇和甘露醇，兩者常結(jié)合在一起配合使用?，F(xiàn)在很多人用葡萄糖代替糖醇。（6）pH及滅菌

一般pH為5.6-6.0之間，培養(yǎng)基偏酸不利于與原生質(zhì)體的培養(yǎng)。（7）常用培養(yǎng)基：MS、B5、N6.2、養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25-27度，光照16h/d左右，靜置為主，但為了不使細(xì)胞集聚，最初幾天需要經(jīng)常輕輕搖動，以助通氣。有些材料不需要光照，所以依材料而定培養(yǎng)條件。3、與同種材料的不同基因型二、培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)平板培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法飼養(yǎng)層培養(yǎng)法原生質(zhì)體懸浮液1mm厚液體培養(yǎng)基2x105/ml1、液體淺層培養(yǎng)2、平板培養(yǎng)

原生質(zhì)體純化、離心、稀釋后，再與1.4%瓊脂或瓊脂糖（37

C左右）等體積混合成0.7%，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。3、雙層培養(yǎng)法（固、液培養(yǎng)）

培養(yǎng)皿底部鋪一層0.7%瓊脂糖的固體培養(yǎng)基，在其上進(jìn)行原生質(zhì)體淺層培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基4、飼養(yǎng)層培養(yǎng)方法一：X-射線殺死原生質(zhì)體，與生活力正常的原生質(zhì)體混合，加入0.7%瓊脂，制成混合液，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。方法二：X-射線殺死原生質(zhì)體，與0.7%瓊脂混合，在培養(yǎng)皿中鋪成平板，作為飼養(yǎng)層，再將生活力正常的原生質(zhì)體與0.7%瓊脂混合，培養(yǎng)于飼養(yǎng)層上。4、飼養(yǎng)層培養(yǎng)1、細(xì)胞壁再生：原生質(zhì)體培養(yǎng)后1-2天即可合成完整細(xì)胞壁，只有形成完整細(xì)胞壁的細(xì)胞才能進(jìn)入細(xì)胞分裂。2、細(xì)胞分裂、愈傷組織或胚狀體形成3、植株再生途徑：（1）通過愈傷組織形成不定芽；該途徑占多數(shù)。（2）原生質(zhì)體再生細(xì)胞直接形成胚狀體。植株再生問題探究第一次分裂第二次分裂第三次分裂多細(xì)胞團(tuán)原生質(zhì)體的分裂肉眼可見細(xì)胞團(tuán)愈傷組織器官發(fā)生途徑胚胎發(fā)生途徑植株植株再生途徑煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)實驗過程示意圖A把作了表面消毒的煙草葉片的下表皮撕掉，露出葉肉組織；b切取小塊葉肉組織，漂浮在纖維素酶和果膠酶等混合液，緩緩振動使游離出原生質(zhì)體；c通過密度梯度離心收集原生質(zhì)體；d分別作微滴培養(yǎng)，飼養(yǎng)培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；e愈傷組織培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)；f再生植株原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交

——原生質(zhì)體融合方法

植物組織培養(yǎng)技術(shù)定義：原生質(zhì)體融合也叫做體細(xì)胞雜交，使分離出來的不同親本的原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互融合成一體，形成雜種細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育成雜種植株的技術(shù)。原生質(zhì)體融合體細(xì)胞雜交：通過物理或化學(xué)的方法使原生質(zhì)體融合，通過培養(yǎng)獲得具有雙親遺傳物質(zhì)的后代。也叫做原生質(zhì)體融合。問題探究一、原生質(zhì)體融合意義—克服雜交不親合—克服生殖器官敗育—克服柑桔多胚對照果實處理果實對照種子處理種子

１９６０年英國生物學(xué)家科金發(fā)明了用酶脫除細(xì)胞壁的方法，給植物細(xì)胞融合技術(shù)掃清了第一道障礙。在許多研究人員成功地進(jìn)行了不同植物的細(xì)胞融合，并培養(yǎng)出了再生植株后，許多人開始嘗試培育不同種屬的超級雜交植物。１９７８年，德國的梅羅帕斯博士用細(xì)胞融合的方法培育出了馬鈴薯（土豆）和番茄的雜交后代———薯番茄。

先用酶液除去馬鈴薯、番茄的細(xì)胞壁，然后將兩種去壁細(xì)胞（原生質(zhì)體）等量混合，在混合液中加進(jìn)聚乙二醇溶液，使原生質(zhì)體緊密粘聚，再用高鈣和高ｐＨ溶液處理，結(jié)果，馬鈴薯與番茄兩種原生質(zhì)體的融合率竟高達(dá)４０％～５０％。他們也曾進(jìn)行過有性雜交的實驗，但都失敗了。

01ｅ26超級雜交水稻

通過秈粳亞種間雜交，獲得超級優(yōu)質(zhì)雜交晚稻01ｅ26，該品種具有產(chǎn)量高、抗性強、米質(zhì)優(yōu)等特點.2003年開始在寧海、溫嶺、溫州、福建4個不同緯度的基地試種，其中溫嶺測產(chǎn)每畝突破750公斤。

01e26超級雜交晚稻番茄+馬鈴薯

1978年，德國科學(xué)家梅羅帕斯博士向世界宣告，他用馬鈴薯與番茄相結(jié)合，得到了地上部分結(jié)青色果實的“薯番茄”，但地下尚未結(jié)出馬鈴薯的塊莖。后來，美國堪薩斯州立大學(xué)的科學(xué)家，把番茄和馬鈴薯的細(xì)胞部分融合在一起，培育出了地上結(jié)黃色果實、地下長白色薯塊的“番茄薯”，據(jù)說番茄的產(chǎn)量很高。二、植物體細(xì)胞雜交的主要程序：原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體融合雜種細(xì)胞的選擇雜種細(xì)胞的培養(yǎng)雜種植株的鑒定融合過程

產(chǎn)生的融合子中可能有雜合雙倍體和單倍重組體不同的類型三、融合方法1、自發(fā)融合自發(fā)融合是在酶解細(xì)胞壁過程中，由于細(xì)胞間連絲的擴(kuò)展和黏連，有些相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體，每個同核體包含2－40個核。

無機鹽誘導(dǎo)融合高pH-高Ca離子聚乙二醇(PEG)法

PEG結(jié)合高鈣-高pH誘導(dǎo)法電融合技術(shù)2、誘發(fā)融合

由于質(zhì)膜表面帶負(fù)電性，原生質(zhì)體間互相排斥，所以要采用一定的誘導(dǎo)方法，能促進(jìn)原生質(zhì)體的融合。不同來源的原生質(zhì)體融合形成的雜種原生質(zhì)體叫做異核體。(一)無機鹽誘導(dǎo)融合:NaNO3法

1972年：Carlson誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合獲得首例雜種植株粉藍(lán)煙草和朗氏煙草體細(xì)胞雜種。NaNO3的作用：中和質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起不足：誘導(dǎo)頻率不高。1973年：Keller用pH10.5的50mMCaCl2溶液在37℃時，誘發(fā)煙草葉肉原生質(zhì)體融合。優(yōu)點：雜種產(chǎn)量高。不足：高pH值對細(xì)胞有毒害作用。（二）高pH-高Ca離子法（聚乙二醇）（三）PEG法PEG法原理PEG是一種帶負(fù)電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質(zhì)體凝聚。在洗脫過程中，PEG將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排隊導(dǎo)致一個原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合。PEG：略帶負(fù)電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋的作用，可使原生質(zhì)體凝聚。PEG法示意圖-+-橋梁+-PEG被洗掉+-+-電荷重排+-+-+-+-膜接觸PEG法特點：融合頻率高可重復(fù)性強誘發(fā)融合無特異性毒性較低植物+植物植物+動物動物+酵母PEG處理特點：有異核體形成頻率高、重復(fù)性高、對細(xì)胞的毒性低、融合誘導(dǎo)無特異性。最為常用。具體做法：在無菌條件下混合雙親原生質(zhì)體----滴加PEG溶液，搖勻，靜置---滴加高鈣-高pH溶液，搖勻，靜置---滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌數(shù)次---離心獲得原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)---篩選---再生雜合細(xì)胞（四）PEG結(jié)合高鈣-高pH誘導(dǎo)法Ca2＋：可以在蛋白質(zhì)（或磷脂）與PEG的負(fù)極性基團(tuán)間形成橋，因而可促進(jìn)粘連。(五)電融合技術(shù)電融合儀

在現(xiàn)代生物學(xué)研究中，細(xì)胞電融合是單克隆抗體制備、哺乳動物克隆以及抗腫瘤疫苗制備等最新方法中的一個基本步驟。與通過聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)細(xì)胞融合的化學(xué)方法相比，細(xì)胞電融合是一種更高效的方法。

Zimmermann教授于1978年創(chuàng)立了細(xì)胞電融合的方法。從那以后，他一直致力于進(jìn)一步發(fā)展該技術(shù)。Senda1979年首先用此方法實現(xiàn)原生質(zhì)體融合1.電融合法原理

交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠。+-負(fù)極正極+-+-+-+-+-+-+-+-

施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-細(xì)胞融合儀

細(xì)胞先在交流電場中聚集，然后通過直流脈沖融合。特定的緩沖液體系可幫助完成高效的細(xì)胞電融合。A．聚集通過雙向電泳，細(xì)胞互相緊密接觸。B．融合脈沖采用僅僅15微秒的方波脈沖穿透細(xì)胞膜，細(xì)胞膜隨后發(fā)生融合。C．異核體期細(xì)胞膜完全融合，細(xì)胞質(zhì)也完全混合。只有細(xì)胞核仍然保持分離狀態(tài)D．完全融合產(chǎn)物現(xiàn)在細(xì)胞核也發(fā)生了融合。根據(jù)常識，染色體數(shù)量下降。ABCD2.電融合的過程燕麥原生質(zhì)體的融合電融合技術(shù)的優(yōu)點：避免PEG、高pH、高Ca2＋這些非正常生理條件；融合條件數(shù)據(jù)化，便于控制與相互比較。其他方式融合

神舟四號飛船上進(jìn)行的太空細(xì)胞順利融合，返回艙里的電融合儀內(nèi)孕育出首批國產(chǎn)太空生命。應(yīng)用舉例二十世紀(jì)80年代末，細(xì)胞電融合技術(shù)被用于從胚胎細(xì)胞克隆哺乳動物。

單克隆抗體制備G.Kohler和C.Milstein將能產(chǎn)生特異性抗體的原代B淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，創(chuàng)立了單克隆抗體制備這種革命性的制備抗體的方法。無數(shù)的融合產(chǎn)物經(jīng)分離和篩選后，將符合要求的單個細(xì)胞作為克隆進(jìn)行擴(kuò)增，這就是使用“單克隆”一詞的原因。這種融合產(chǎn)物被稱為雜交瘤.三、體細(xì)胞雜種細(xì)胞篩選與鑒定1．互補選擇法2、機械分離雜種細(xì)胞法3.雙熒光標(biāo)記選擇法原生質(zhì)體發(fā)生融合時，有相當(dāng)一部分并未融合，或發(fā)生的是非目的性融合，所以會呈現(xiàn)多種融合狀態(tài)，故有必要進(jìn)行篩選出異核體，其主要方法有：1.互補選擇法(1)遺傳互補選擇法

采用缺陷型親本進(jìn)行融合產(chǎn)生野生型雜種，從而從整體水平進(jìn)行有效選擇。另外也可以利用原生質(zhì)體對藥物，抗生素的不同抗性來進(jìn)行篩選。

(2)營養(yǎng)互補選擇法也稱生理互補法

指親本雙方都有營養(yǎng)缺陷的情況下，只有雜種細(xì)胞能在選定的特種培養(yǎng)基上生存，而親本雙方皆不能生存.

如粉藍(lán)煙