elisa法檢測乙肝標(biāo)志物干擾因素分析

elisa法檢測乙肝標(biāo)志物干擾因素分析

基于免疫過敏技術(shù)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)（elisa），以e免疫氧化技術(shù)為基礎(chǔ)，敏感性高，特異性強(qiáng)，操作簡單，易于觀察和大規(guī)模檢查。由于其自身方法學(xué)上的限制,檢測結(jié)果易受其它血清物質(zhì)變化及實(shí)驗(yàn)室因素的干擾。本文分析ELISA法檢測乙肝標(biāo)志物的干擾因素及控制方法。1樣品處理1.1樣品數(shù)量不足標(biāo)本量不足會(huì)直接影響檢驗(yàn)結(jié)果。因此,在抽取樣本時(shí)要抽出足夠量的血液標(biāo)本,以便得到足夠的血清(血漿)。1.2血紅蛋白的代謝溶血的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈,殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣的活性,催化底物顯色造成假陽性。因此,在采血過程中,要保證采血順暢,不要進(jìn)行劇烈震蕩,避免產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。1.3血管采集不足塑料試管能吸附抗原物質(zhì),樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。最好使用一次性玻璃試管或真空采血管。1.4抗凝試驗(yàn)可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果如肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值,可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān)。1.5假陽性結(jié)果陰血藥濃度這樣會(huì)使血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可形成肉眼可見的纖維蛋白塊或附著在酶標(biāo)板孔壁內(nèi)使酶標(biāo)記物不易洗掉,易造成假陽(陰)性結(jié)果。所以,血液標(biāo)本應(yīng)置于室溫下1～2小時(shí),使血液凝固,然后離心檢測或讓血液過夜后再檢測。離心時(shí)還可加大離心轉(zhuǎn)速,延長離心時(shí)間,使血細(xì)胞和纖維蛋白充分沉淀,血液充分收縮,讓標(biāo)本中的非特異物質(zhì)所致假陽性率降至最低。2操作過程2.1微量加樣器的清洗不能將纖維蛋白原或血細(xì)胞帶入反應(yīng)微孔中,避免出現(xiàn)假陽性或假陰性;加樣器吸頭的潔凈與否和吸量的準(zhǔn)確性直接影響檢測結(jié)果,因此,加樣器要經(jīng)常清洗,定期校準(zhǔn);加樣速度不可太快,加樣太快無法保證微量加樣器的準(zhǔn)確性和均一性;避免加在孔壁上部,加在孔壁上部的非包被區(qū)易導(dǎo)致非特異性吸附;避免樣本濺出或產(chǎn)生氣泡,濺出會(huì)對鄰近孔造成污染,出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。2.2滴加、加時(shí)孔內(nèi)非特異滴加試劑時(shí)一定注意滴加的角度和速度,滴加太快容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間,這樣會(huì)在孔內(nèi)非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附,而引起非特異顯色。2.3溫度不高,存在“花板”封板時(shí)一定要封嚴(yán),一是防止污物浸入,二是防止溫育時(shí)陽性標(biāo)本的液體蒸發(fā),產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。溫育時(shí)要求固相板放入水中,減少受熱不均。反應(yīng)溫度要達(dá)到37℃,溫度太低,可能會(huì)出現(xiàn)弱陽性標(biāo)本測定漏檢情況。保溫時(shí)間不易過長,時(shí)間過長可能有部分包被物質(zhì)會(huì)釋放至液相中與樣品抗體(或抗原)結(jié)合,影響實(shí)驗(yàn)的正確性和靈敏度。2.4洗液要放置23步法手工洗板時(shí)應(yīng)注意避免液體濺出或孔與孔之間的液體溢出,連成整體液面后產(chǎn)生“花板”現(xiàn)象。每次加入洗液后,一定要放置2～3分鐘,然后甩干,甩板的速度一定要快,這樣可以避免洗液甩入鄰孔。用洗板機(jī)洗板時(shí),一定注意洗液量要充足,洗板針要通暢。洗板時(shí)應(yīng)防止針口上有纖維蛋白或異物,這些異物在洗板過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。洗板機(jī)不用時(shí)應(yīng)用去離子水清洗幾遍。2.5加入最終溶液加入終止液時(shí)要避免滴液產(chǎn)生氣泡,從而導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)。所加的終止劑一定要密閉保存或新鮮配制,以免終止劑失效而影響試驗(yàn)結(jié)果。3試劑及反應(yīng)微孔操作前將試劑在室溫平衡30分鐘,是為了保證試劑及反應(yīng)微孔在育溫過程中能夠較快達(dá)到所要求的溫度。使用劣質(zhì)試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽性或假陰性,選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。4干擾物質(zhì)檢測結(jié)果有學(xué)者認(rèn)為,大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì),可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有類風(fēng)濕因子(RF)、甲胎蛋白(AFP)因子、補(bǔ)體。某些自身抗體都會(huì)影響結(jié)果造成假陽性。5hd-hool效應(yīng)一些標(biāo)本中抗原含量過高,產(chǎn)生HD-HOOK效應(yīng)。由于HD-HOOK效應(yīng)產(chǎn)生的假低值假陰性而導(dǎo)致漏診。遇到這樣的標(biāo)本,可以做梯度稀釋進(jìn)行檢測或用線性范圍高的兩對半