elisa試驗常見質(zhì)量問題的分析

elisa試驗常見質(zhì)量問題的分析

elisa試驗具有高度的靈敏度和良好的特異性特點。但操作中的每個環(huán)節(jié)對試驗的檢測結(jié)果影響較大,如不按常規(guī)操作,可以導致顯色不符,花板等情況。下面將操作中每個環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決方法總結(jié)如下,以提高檢驗質(zhì)量,減少試驗誤差,更好地為臨床服務。在試驗工作中,首先試劑要優(yōu)良。我們實驗室測乙肝兩對半及丙肝抗體用的是廈門新創(chuàng)的試劑,必須嚴格按照操作步驟進行操作,同時做好室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評,以嚴格的工作作風檢驗每一份標本,才能保證檢測質(zhì)量。全自動酶標儀的應用,對于實現(xiàn)ELISA標準化檢測,提高檢測質(zhì)量起到了重要作用。加樣、減菌、洗板、加色選擇試劑:要選擇試劑質(zhì)量優(yōu)良的檢測試劑,嚴格按照說明書進行操作,操作前將試劑從冰箱冷藏格取出,在室溫下平衡30～60分鐘。加樣:標本為血清時,最好待血清在乳膠管中5分鐘徹底凝固后,再用4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘,使血清和血球、纖維蛋白完全被凝膠分開;若標本為血漿,必須使用含抗凝劑血液標本收集管,采血后必須立即顛倒混合5～10次,放置一段時間后,用3000轉(zhuǎn)/分鐘,離心15分鐘。若需在幾天內(nèi)檢測,可放在2～8℃冰箱中,若要久置貯存,則置于-20℃的低溫冰箱內(nèi)(加樣后及時放入37℃水浴箱,加酶結(jié)合物后用吸水紙在加樣板表面輕拭吸干,標本較多時,分批加樣測定)。如果血清或血漿標本分離不好即進行加樣,加入的血清易出現(xiàn)凝固,影響陰陽性檢測;手工操作中,加樣板過多造成加樣后放入37℃水浴箱前等待時間過長(特別是室溫較高時);另外加完樣本再加酶結(jié)合物時,酶試劑濺出孔外等,均影響結(jié)果。孵育:孵育時加樣版貼封片,按說明書步驟嚴格控制操作時間;若孵育時未貼封片,使標本稀釋液蒸發(fā),吸附于孔壁,容易清理不徹底;孵育時間人為延長,導致非特異性結(jié)合,緊附于反應孔周圍,不易清洗,影響結(jié)果。洗板:保證洗液注滿各孔,洗板機暢通,洗完板后,最好在吸水紙上輕輕拍干(選擇干凈,無或少塵的吸水材料);合理安排,盡量縮短洗板時間。若采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉;采用半自動洗板機洗板時,洗液量不足,導致洗板不徹底;洗板針堵塞,抽吸不完全,洗板不暢,導致洗板效果差,均影響試驗結(jié)果。顯色:顯色劑盡量臨用前配制,不用過期的顯色劑,肉眼可見淺藍色的顯色劑不能用;加樣時保持顯色劑不外流,A、B液應避免接觸金屬器械;若顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑,加顯色劑時濺出孔外造成液體回流,均影響試驗結(jié)果。終止液:加終止液時應避免產(chǎn)生氣泡,若加終止液時產(chǎn)生較多氣泡,導致假陽性增加。讀板:讀板時應保證酶標板清潔,若酶標板板底不清潔,影響試驗結(jié)果判定。若整套試驗嚴格按上述操作,還需在整個操作過程中保證酶樣板和測試試劑均不能接觸次氯酸,實現(xiàn)ELISA檢測標準自動化,有效提高檢測質(zhì)量。elisa測定總抗體的確定和酶的復配ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)的簡稱,它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自20世紀70年代初問世以來,發(fā)展十分迅速,目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領(lǐng)域。原理:ELISA是以免疫學反應為基礎,將抗原、牽9體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體-聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行,每加入一種試劑孵育后,可通過洗滌除去多余的游離反應物,從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應用中,通過不同的設計,具體的方法步驟可有多種。即用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。注意事項:①正式試驗時,應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應作一式二份,以保證實驗結(jié)果的準確性。有時本底較高,說明有非特異性反應,可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。②在ELISA中,進行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進行篩選:用等量抗原包被,在同一實驗條件下進行反應,觀察其顯色反應是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求pH在9.0～9.6。吸附溫度,時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進行包被后,在其它試驗條件相同時,觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg/ml。酶標記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部分)。然后再固定其他條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應,而本身無色。有