細胞培養(yǎng)基本知識基本技術(shù)

細胞培養(yǎng)的根本知識、根本技術(shù)醫(yī)學院中心實驗室谷景義編輯ppt主要內(nèi)容：1、細胞培養(yǎng)根本知識2、培養(yǎng)細胞生長的條件3、細胞培養(yǎng)的根本技術(shù)編輯ppt一、

細胞培養(yǎng)把取得的組織用機械或消化的方法分散成單個細胞，用培養(yǎng)基制成細胞懸液，在體外適宜條件下，使細胞生長繁殖，并保存其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。編輯ppt培養(yǎng)細胞的特性1-生長方式及類型貼附型、懸浮型編輯ppt培養(yǎng)細胞的特性2-增殖特點體外培養(yǎng)的細胞既保持了一定的體內(nèi)細胞的根本特性，但也具有本身的一些特點。貼附-伸展接觸抑制-增殖的密度抑制編輯ppt貼附-伸展編輯ppt接觸抑制當一個細胞被其他細胞圍繞導致無處可去而保持接觸時，細胞不再移動，在接觸區(qū)域的細胞膜活動將停止。因此，一般正常細胞并不相互重疊于其上生長。編輯ppt細胞增殖密度抑制當細胞生長集合形成單層時，細胞變得比較擁擠，這時其分裂停止，這種細胞可在靜止狀態(tài)下維持存活一段時間，但不會繼續(xù)分裂生殖。轉(zhuǎn)化細胞或惡性腫瘤細胞與正常細胞不同，他們的接觸抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以增殖至較高的終末細胞密度。編輯ppt培養(yǎng)細胞的特性3-生長過程單個細胞增殖：細胞周期編輯ppt高等生物體，細胞周期時間的長短變化主要集中在G1期，S，G2和M期根本保持穩(wěn)定。Hela8-16h5-9h2-8h20-28h編輯ppt一群細胞的增殖：細胞生長曲線接種后，每天進行檢測計數(shù)，以細胞數(shù)為縱坐標，以時間為橫坐標，繪制成曲線。測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，是培養(yǎng)細胞生物學特性的根本參數(shù)之一。飽和密度：在特定條件下，培養(yǎng)器皿內(nèi)能到達的最高細胞數(shù)，當細胞到達飽和密度后細胞群體停止繁殖。編輯ppt潛伏期/滯留期指數(shù)增長期平臺期/停滯期退化或死亡編輯ppt細胞系的生長過程細胞系：原代培養(yǎng)細胞經(jīng)首次傳代成功后即成為細胞系，可泛指一般可以傳代的細胞。細胞株：通過篩選或克隆化，從原代細胞或細胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標志物的細胞。細胞系亞系：由某一細胞系別離出來，在性狀上與原細胞系不同的細胞系，稱該細胞系的亞系編輯ppt有限細胞系：如果不能繼續(xù)傳代或傳代有限，可稱為有限細胞系。連續(xù)細胞系：能夠連續(xù)傳代的細胞叫做“連續(xù)細胞系或無限細胞系。可培養(yǎng)50代以上并無限培養(yǎng)下去。大多數(shù)的二倍體細胞為有限細胞系。無限細胞系大多已發(fā)生變異。編輯ppt原代細胞：從機體取得組織材料，在體外培養(yǎng)生長，到第一次傳代前。傳代細胞：當原代細胞持續(xù)生長繁殖一段時間，到達一定的細胞密度后傳代的細胞。編輯ppt培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法方法：將培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，再放入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。優(yōu)點：1、可以防止培養(yǎng)瓶外表粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響。2、可以方便地進行顯微鏡觀察、染色等操作，以及永久保存。3、增加了培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面積。編輯ppt培養(yǎng)板培養(yǎng)法方法：將培養(yǎng)細胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。應培養(yǎng)量較小也稱為微量培養(yǎng)。編輯ppt懸滴培養(yǎng)法也稱植塊懸滴培養(yǎng)法，是最早建立的體外培養(yǎng)技術(shù)根本要點：將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營養(yǎng)液懸掛在蓋玻片下，再放置于一凹形載片之上，最后用溶蠟密封后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。編輯ppt1907年-Harrison用細胞培養(yǎng)解決一個難題蓋玻片覆蓋凹型載玻片懸滴培養(yǎng)法編輯ppt懸滴培養(yǎng)法根本步驟1、在蓋玻片上滴加胚胎提取液、血漿和植塊，混勻。培養(yǎng)基凝固后將植塊包埋。2、在凹載片周圍涂凡士林。將凹載片向下壓向蓋玻片3、將凹載片反轉(zhuǎn)，蓋玻片周圍涂溶蠟。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)編輯ppt1910至1923年–Carrel和早期的組織培養(yǎng)卡氏瓶培養(yǎng)法編輯ppt1943年Earle、Dulbecco等創(chuàng)立單層細胞培養(yǎng)法，首建長期傳代的L-細胞系。1951年Gey首建人腫瘤細胞——Hela細胞系。從50年代末開始，組織培養(yǎng)技術(shù)應用進入了一個繁盛的階段，廣泛應用于生物學和醫(yī)學研究各個領(lǐng)域。編輯ppt無血清培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基:是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。根本成分為根底培養(yǎng)基及添加組分兩大局部。觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)〔抗體、生長因子〕的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。往往針對性很強，價格偏高。編輯ppt三維細胞培養(yǎng)技術(shù)

將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養(yǎng),使細胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長,構(gòu)成三維的細胞-載體復合物。編輯ppt普通的細胞培養(yǎng)由于細胞在體外改變的環(huán)境下增生逐漸喪失了原有的性狀，往往和體內(nèi)情況不相符，而動物實驗完全在體內(nèi)進行,但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復雜化,難以研究單一過程，且難以研究中間過程。三維細胞培養(yǎng)技術(shù)是介于單層細胞培養(yǎng)與動物實驗之間的一種技術(shù)，既能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境，又能展現(xiàn)細胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。應用：軟骨和骨組織〔軟骨細胞和干細胞，再生損傷的軟骨、骨〕循環(huán)系統(tǒng)和心臟〔有目的地改變血管形成〕編輯ppt目前常用的三維培養(yǎng)模型：基質(zhì)覆蓋培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)微載體培養(yǎng)預置支架培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)自發(fā)性細胞聚集編輯ppt細胞培養(yǎng)技術(shù)的特點及應用優(yōu)點：1〕研究的條件可以人為控制2〕研究的樣本均一3〕研究內(nèi)容方便觀察、檢測、記錄4〕研究的費用相對于經(jīng)濟缺點：體外培養(yǎng)的細胞不能完全等同于體內(nèi)的細胞。編輯ppt應用病毒學：病毒鑒定，病毒抗原作用，疫苗生產(chǎn)……免疫學：雜交瘤-單克隆抗體……遺傳學：染色體分析……腫瘤學：篩選重要的抗腫瘤藥物……分化及發(fā)育：刺激使細胞群體發(fā)生改變……細胞毒實驗：藥效測試……臨床醫(yī)學及生物技術(shù)：干細胞培養(yǎng)定向誘導分化后移植；組織工程軟骨損傷修復；試管嬰兒……編輯ppt營養(yǎng)需要環(huán)境要求無毒及無污染二、培養(yǎng)細胞生長的條件編輯ppt1、細胞的營養(yǎng)需求〔1〕氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子〔2〕促生長因子等完全培養(yǎng)基的組成：根底培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升編輯ppt根底培養(yǎng)基的選擇參考：(1〕建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應是培養(yǎng)這種細胞首選的培養(yǎng)基。可以查閱參考文獻，或在購置細胞株時咨詢。(2)其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細胞。(3)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最正確培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640〔標準型〕、DMEM-高糖〔標準型〕、DMEM-低糖〔標準型〕、DMEM-F12等……編輯ppt血清熱滅活：56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清(目前少用〕熱滅活目的：滅活血清中的補體成分。如果不做細胞因子和免疫相關(guān)的實驗，建議血清不要滅活。

熱處理造成血清沉淀物增多，影響血清質(zhì)量。甚至嚴重影響細胞生長速度，且細胞貼壁率降低。血清中的沉淀物絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理顯微鏡下“小黑點〞：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點〞，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如果疑心血清質(zhì)量，那么應立即停止使用，更換另一批號的血清編輯ppt血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清：胎牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。編輯pptpH調(diào)整液NaHCO3溶液〔堿〕常用濃度為7.5%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存HEPES〔分子量238.31〕溶液一種弱酸，羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，假設(shè)加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES使用終濃度一般為10-50mmol/L常配成1M儲存液：用20ml雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時可向100ml培養(yǎng)液中參加2mlHEPES濃縮液，終濃度為20mmol/L編輯ppt抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。最終使用濃度為每毫升100單位。

編輯ppt制備1000mlRPMI

1640培養(yǎng)基RPMI

1640

干粉培養(yǎng)基10.4g〔1包〕

超純水

400ml

↓

磁力攪拌至完全溶解

↓

加超純水定容至1000ml

在超凈臺內(nèi)無菌條件下，用滅菌后的并置有0.22μm孔徑濾膜的過濾器除菌，分裝200ml/瓶，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用前取一瓶溶解，每200ml培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。編輯ppt消化液別離組織和分散細胞常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)單獨或混合使用編輯ppt胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞別離。

胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用編輯ppt胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks平衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補足D-Hanks平衡鹽溶液〔常用濃度為0.25%〕攪拌混勻，置室溫4小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中，-20℃保存?zhèn)溆谩惨悦夥纸馐А?，胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7.2左右胰蛋白酶溶液配制編輯pptEDTA·4Na溶液一種化學螯合劑，對細胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。

注意：使用EDTA處理細胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會影響細胞生長編輯pptD-Hanks’

平衡鹽溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g

編輯ppt2、

環(huán)境要求細胞培養(yǎng)必須具備細胞生存并繁殖的生理學能接受限度內(nèi)的物理化學特性〔1〕溫度〔2〕氣相〔3〕PH編輯ppt溫度體外培養(yǎng)的細胞需要在保持一定恒溫的環(huán)境中才能生長。在到達最適溫度〔37°〕前，一般細胞繁殖率因溫度的升高而增加，但是，溫度逐步升高并超過最適溫度時，繁殖會被抑制。當溫度在25°-35°，細胞的生長速度很慢，但能夠生存；細胞在4°也能存活數(shù)天；只要溫度不低于0°，細胞都能生存；加了保護劑還能放到液氮中保存。當高溫時，在41°-42°中培養(yǎng)1h，細胞損傷嚴重，43°以上，那么多數(shù)細胞死亡。高溫比低溫對細胞的影響更為明顯。編輯ppt氣相和PH5%CO2+95%空氣混合氣體〔O2〕。CO2既是細胞生長所需，同時又是細胞代謝的產(chǎn)物，并與維持培養(yǎng)基的PH有關(guān)。最適PH7.2–7.4低于PH6.8或高于PH7.6可能對細胞有害，甚至死亡。酚紅指示劑：黃–6.6–橙–8.0–紅編輯ppt3、無毒無污染無毒：無毒是培養(yǎng)細胞的必需條件。凡與細胞直接或間接接觸的東西都必須是無毒的。假設(shè)具細胞毒性，細胞容易導致死亡。因此，選用器皿和材料時必須注意。編輯ppt無污染微生物的污染不同細胞類型的交叉污染細菌霉菌支原體體外培養(yǎng)的細胞缺乏機體免疫系統(tǒng)，無防御能力，一旦發(fā)生細菌等污染，細胞最終會死亡。交叉污染容易使細胞系失去原有特性。編輯ppt三、細胞培養(yǎng)根本技術(shù)1、原代細胞培養(yǎng)2、傳代細胞培養(yǎng)3、培養(yǎng)細胞生長狀況的觀察4、細胞凍存、復蘇、運輸編輯ppt無菌操作中的本卷須知在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔操作前,無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30分鐘滅菌，以75%或70%ethanol擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10分鐘操作時，小心取用無菌之實驗物品，防止造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在翻開之容器正上方操作實驗。容器翻開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用操作過程中注意，有菌意識，無菌操作！編輯ppt1、原代細胞培養(yǎng)原理：將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶〔常用膠原酶〕或組織貼壁法處理，得到單個細胞或細胞群，置適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖。儀器、材料及試劑：CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)瓶、平皿、燒杯、吸管、移液槍、手術(shù)器械、計數(shù)板、離心機、水浴箱〔37℃〕1640/DMEMF12培養(yǎng)基〔含10%血清〕，2%膠原酶II，PBS，酒精編輯ppt組織消化法1.準備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒30分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2.處理組織：采集的標本必須在4H內(nèi)完成。取出6-10cm長臍帶，置于燒杯或平皿中，用PBS液漂洗2~3次，去除血污；如疑心組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。編輯ppt3.剪切：用手術(shù)剪將組織塊剪成2~3立方毫米大小，然后再用眼科剪把組織剪細成1立方毫米的小塊，以便于消化。參加與組織塊總量1：1的2%膠原酶II，然后一并倒入瓶中，封口。4.消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。37℃空氣搖床100轉(zhuǎn)/min，1.5-2h編輯ppt5.別離：待組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，并倒入至少5倍體積的PBS稀釋消化液，隨即通過200目的不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。2500rmp離心消化20分鐘，吸出上清，參加8-10mlPBS，1000rmp離心5min，吸出上清，參加適量含有血清的培養(yǎng)液。6.計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。7.換液：24-48H后觀察細胞是否貼壁，如已有局部細胞貼壁，可換液繼續(xù)培養(yǎng)。編輯ppt2、傳代細胞培養(yǎng)傳代前的準備1.酒精，棉球，鑷子，雜物盒，試管，吸管筒，離心管，培養(yǎng)瓶或板，計時器，筆2.0.25%胰蛋白酶3.含血清培養(yǎng)基，PBS編輯ppt傳代步驟〔貼壁細胞〕：1.鏡下觀察細胞生長至融合狀態(tài)2.吸出舊的培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液或PBS清洗兩次〔切記要清洗干凈〕。3.消化細胞：最常用的方法是在培養(yǎng)瓶中添加1ml0.25%含EDTA的胰酶，培養(yǎng)箱中37°消化5-15s。可根據(jù)不同的細胞類型調(diào)整消化時間及程度。在電鏡下觀察，當細胞突起回縮，細胞之間間隙增大，細胞近乎縮成圓形即可。編輯ppt4.終止消化：立即參加含有血清的培養(yǎng)基，用吸管吹打分散細胞，吹打動作不可過猛，力度要適中，否那么容易損傷細胞并產(chǎn)生能傷害細胞的氣泡。5.1000rmp離心5min，棄上清。6.用培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)并調(diào)整細胞密度。編輯ppt3、培養(yǎng)細胞生長狀況的觀察常規(guī)觀察：培養(yǎng)液顏色〔是否變黃〕生長增殖變化〔經(jīng)歷到哪個時期，長滿否〕形態(tài)變化〔透明度、折光性、細胞輪廓〕微生物污染〔細菌、霉菌〕可用顯微鏡觀察活細胞及其動態(tài)編輯ppt細胞生長狀況的觀察細胞計數(shù)：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。

編輯ppt1.

將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板。

2.

將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。3.

計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按公式計算：

細胞數(shù)/mL=四大格細胞總數(shù)/4×104說明：公式中除以4，因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù)。

公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm〔長〕×1.0mm〔寬〕×0.1mm〔高〕=0.1mm3

而

1ml=1000mm3

〔注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，假設(shè)細胞團10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液編輯ppt細胞生長曲線〔細胞計數(shù)〕細胞周期〔流式〕細胞分裂指數(shù)〔細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)〕細胞貼壁率編輯ppt4、細胞凍存、復蘇及運輸及時進行細胞凍存十分必要：細胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存3個月到一年之久；細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。編輯ppt原理：細胞凍存及復蘇的根本原那么是慢凍快融，可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用二甲基亞砜或甘油作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法。這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，防止由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。編輯ppt凍存步驟1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%血清的凍存培養(yǎng)液；2.取對數(shù)生長期的細胞，用胰酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞那么直接將細胞移至15ml離心管中；3.離心1000rpm，5min；4.去除胰酶及舊的培養(yǎng)液，參加適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml；

編輯ppt5.將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5ml；6