寧夏干旱帶壓砂甜瓜肺病病原菌的分離鑒定

寧夏干旱帶壓砂甜瓜肺病病原菌的分離鑒定

杏仁是一種常見的甘蔗疾病，通常被稱為“白病”。這種疾病很常見。它對瓜的生產(chǎn)產(chǎn)生了嚴重影響，降低了60%的糖產(chǎn)量。同時，它還會影響杏仁的成熟度和養(yǎng)分，從而降低杏仁的品質(zhì)。目前,對瓜類白粉病病原菌鑒定主要依靠觀察病原菌閉囊殼、分生孢子及萌發(fā)方式等顯微形態(tài),或用鑒定寄主法鑒定其生理小種。但由于白粉病病原菌無性階段形態(tài)相似,有性階段的閉囊殼不經(jīng)常出現(xiàn),鑒定寄主法需進行活體試驗,工作量較大、周期長,給白粉病病原菌分類鑒定工作增加難度。rDNA轉(zhuǎn)錄內(nèi)間隔區(qū)(internaltranscribedspacer,ITS)和28SrDNAD1/D2區(qū)已被廣泛應(yīng)用于菌物鑒定、系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系等研究,如利用ITS序列鑒定番茄、黃瓜、小麥等植物白粉病病原菌,利用28SrDNAD1/D2區(qū)序列鑒定橡樹、樸樹白粉病病原菌等,但應(yīng)用ITS和28SrDNAD1/D2區(qū)研究甜瓜白粉病迄今未見報道。本試驗通過分析寧夏中部干旱帶壓砂甜瓜白粉病病原菌ITSrDNA和28SrDNAD1/D2序列,鑒定其分類地位。1材料和方法1.1菌株和儀器供試菌株:甜瓜白粉病病原菌分生孢子,于2009年9月從寧夏自治區(qū)中衛(wèi)市興仁鎮(zhèn)甜瓜品種“玉金香”發(fā)病植株上采集。菜豆叉絲單囊殼白粉菌Podosphaeraphaseoli(GQ927253.1、AB462771.1)、鳳仙花叉絲單囊殼白粉菌P.balsaminae(FJ625796.1、AB462788.1)、菊科單囊殼白粉菌P.fusca(EF137860.1、AB462776.1)、蒼耳單囊殼白粉菌P.xanthii(AB046985.1、AB022410.2)、瓜類叉絲單囊殼白粉菌P.fuliginea(EU294368.1)、飛揚草叉絲單囊殼白粉菌P.euphorbiae-hirta(AB462770.1)、狗肝菜叉絲單囊殼白粉菌P.diclipterae(AB462795.1)和二孢白粉菌Erysiphecichoracearum(AF229018),以上病菌序列號均來自NCBI。試驗儀器和試劑:分子量標準λDNA/HindIIIladder和DNAmarkerD購自Biobasic公司;TaqDNA聚合酶和dNTP等分子生物學(xué)試劑,購自北京全式金生物公司;其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2方法1.2.1chelex-100溶液DNA提取:參照Chelex-100方法,取約500個分生孢子置于1.5mL離心管中,然后加入50μL5%Chelex-100,混勻,56℃水浴4h,旋渦震蕩混勻。沸水浴10min,旋渦震蕩混勻,12000r/min離心5min,取20μL上清在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.2.2pcr擴增ITSrDNA引物:ITS1:5′-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。28SD1/D2區(qū)引物:NL1:5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′;NL4:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。PCR反應(yīng)體系:10×PCR反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)2.5μL、10mmol/LdNTP0.5μL、10μmol/L正反向引物各0.5μL、5U/μLTaq酶0.5μL、基因組DNA10μL,雙蒸水補足25μL。PCR程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃復(fù)性45s,72℃延伸60s,30個循環(huán);72℃延伸5min。擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后直接測序。1.2.3序列比對分析將白粉病病原菌ITSrDNA和28SrDNAD1/D2序列用BLAST在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中比對分析,用ClustalX2.0將序列及其近緣種序列比對排序,以最短序列為標準,手工調(diào)整,對齊5′和3′端。用Mega4.0中鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,應(yīng)用自展法(bootstrap)檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹,自展數(shù)據(jù)集為1000次,去掉支持率<70%分支。2結(jié)果與分析2.1基因組dna的分離采用Chelex-100法從甜瓜白粉病病原菌分生孢子中提取到基因組DNA,大小約25~27kb,呈帶狀,有拖尾現(xiàn)象,說明有部分降解,而且純度不高(圖1)。根據(jù)亮度判斷,濃度約為20~30ng/μL,可滿足PCR要求。2.2pcr擴增條帶取基因組DNA10μL,約200~300ng作為模板,分別用ITSrDNA引物和28SD1/D2區(qū)引物擴增,得到擴增條帶(圖2),擴增產(chǎn)物大小約為600~650bp,與理論長度吻合。2.3不同來源的整株病原菌pcr擴增檢測將ITSrDNA序列命名為nxmpm-ITS,用BLAST在GenBank中搜索同源序列發(fā)現(xiàn),nxmpm-ITS與菜豆叉絲單囊殼白粉菌(GQ927253.1)、鳳仙花叉絲單囊殼白粉菌(FJ625796.1)、菊科叉絲單囊殼白粉菌(EF137860.1)、蒼耳單囊殼白粉菌(AB046985.1)、瓜類叉絲單囊殼白粉菌(EU294368.1)的ITSrDNA序列之間相似度均大于99%。因此,可以確定寧夏中部干旱帶壓砂甜瓜白粉病病原菌屬于叉絲單囊殼屬Podosphaera,但難以確定到種。選擇部分BLAST結(jié)果,以二孢白粉菌的ITS序列(AF229018)為外群(outgroup),構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,nxmpm-ITS與叉絲單囊殼屬Podosphaera內(nèi)許多種聚成一類(圖3)。2.42不同菌株對養(yǎng)殖行業(yè)的影響將28SrDNAD1/D2序列命名為nxmpm-28SD1/D2,用BLAST在GenBank中搜索同源序列,發(fā)現(xiàn)nxmpm-ITS與蒼耳單囊殼白粉菌(AB022410.2)、鳳仙花叉絲單囊殼白粉菌(AB462788.1)、菊科單囊殼白粉菌(AB462776.1)、菜豆叉絲單囊殼白粉菌(AB462771.1)、飛揚草叉絲單囊殼白粉菌(AB462770.1)、狗肝菜叉絲單囊殼白粉菌(AB462795.1)序列相似度均大于99%?？梢源_定,白粉病病原菌為叉絲單囊殼屬Podosphaera,與基于ITSrDNA序列比對分析結(jié)果一致,但種分類依然難以確定。選擇部分BLAST結(jié)果,以二孢白粉菌(AB077687.1)28S部分序列為外群,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4)。3叉絲單囊殼粉菌物種組成鄭儒永和余永年研究認為,我國甜瓜白粉病病原菌屬白粉菌屬葫蘆科白粉菌Eysiphecurbitacacearum和單囊殼屬瓜單囊殼菌Sphaerothecacucurbitae;魏景超則認為屬二孢白粉菌Erysiphecichoracearum和單囊殼屬單囊殼白粉菌Sphacelothecafuliginea,并認為后者較為常見。以上都是根據(jù)病菌有性階段、無性階段顯微形態(tài)特征以及寄主范圍進行分類。本研究根據(jù)病原菌核酸保守序列進行分類,結(jié)果顯示,寧夏中部干旱帶壓砂甜瓜白粉病病原菌為叉絲單囊殼屬Podosphaera的某個種,與前人提出的4個屬相矛盾。但作者發(fā)現(xiàn),在AF011321.1和AF011319.1序列說明中,注釋Sphaerotheca是Podosphaera的異名,因此,傳統(tǒng)分類中認為叉絲單囊殼屬和單囊殼屬是完全不同的兩個屬可能不準確,應(yīng)考慮修訂為同一屬。本研究比對結(jié)果顯示,叉絲單囊殼屬多個種的ITSrDNA和28SrDNAD1/D2序列相似度都大于99%,與同一種內(nèi)微生物ITSrDNA和28SrDNAD1/D2相似度小于1%的原則相矛盾。但作者在AB103368.1序列注釋中發(fā)現(xiàn),菊科叉絲單囊殼白粉菌寄主并不是菊科植