第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法

第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第1頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月微生物純培養(yǎng)的獲得的方法稀釋涂布法劃線分離法利用平皿的生化反應(yīng)分離法：透明圈法、變色圈法、生長(zhǎng)圈法、抑菌圈法“病灶”分離法單細(xì)胞或單孢子分離法特殊菌類——環(huán)保降解菌的分離第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)的獲得和傳統(tǒng)的鑒定方法第2頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月微生物的分離、純化與接種技術(shù)接種和分離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀

第3頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月微生物的分離、純化與接種技術(shù)第4頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月劃線接種，分離純化第5頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月灼燒第6頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第7頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月微生物純培養(yǎng)的獲得的方法無(wú)氮培養(yǎng)基——篩出固氮菌；無(wú)有機(jī)碳源的培養(yǎng)基——篩出硝化細(xì)菌；無(wú)有機(jī)碳源的培養(yǎng)基且無(wú)氧有光環(huán)境——篩出光合細(xì)菌；高濃度NaCl的培養(yǎng)基——篩出耐鹽菌株伊紅—美藍(lán)的培養(yǎng)基——篩出大腸桿菌；青霉素的培養(yǎng)基——篩出酵母菌、霉菌；……第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)的獲得和傳統(tǒng)的鑒定方法第8頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月微生物純培養(yǎng)的獲得的方法

傳統(tǒng)發(fā)酵食品的starter的確定or優(yōu)勢(shì)菌株的確定例如：金華火腿的主要發(fā)酵菌；

優(yōu)勢(shì)細(xì)菌：乳酸菌、葡萄球菌優(yōu)勢(shì)酵母菌：歐諾比假絲酵母、紅酵母微生物生態(tài)學(xué)方面的菌株確定？？非原位檢測(cè)鑒定、原位檢測(cè)鑒定第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)的獲得和傳統(tǒng)的鑒定方法第9頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月檢測(cè)食品中微生物總數(shù)的方法4種基本方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)或好氧平板計(jì)數(shù)，適用于活細(xì)胞或菌落形成單位。（2）最大可能值法。作為一種統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法來(lái)測(cè)定活性細(xì)胞。（3）染色還原技術(shù)。估計(jì)擁有還原能力的活性細(xì)胞數(shù)目。（4）直接顯微鏡計(jì)數(shù)法?；钚院头腔钚约?xì)胞。第10頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)（SPC）

將一部分食品樣品混合或者均質(zhì)化，在適當(dāng)?shù)南♂屢褐羞M(jìn)行梯度稀釋，然后涂布或者傾注到適宜的瓊脂培養(yǎng)基上，在適當(dāng)?shù)臏囟认屡囵B(yǎng)一段時(shí)間后，使用電子計(jì)數(shù)器對(duì)可見的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。SPC法是目前測(cè)定活細(xì)胞數(shù)和食品產(chǎn)品中菌落形成單位數(shù)最廣泛的方法。檢測(cè)食品中微生物總數(shù)的方法第11頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)（SPC）記錄產(chǎn)品中全部活細(xì)胞時(shí)，要考慮以下因素：1）采用的取樣方法2）食品樣品中有機(jī)體的分類3）食品生物區(qū)系的種類4）食品原料的種類5）食品產(chǎn)品的預(yù)檢歷史記錄6）所用培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)程度7）所用的培養(yǎng)溫度和時(shí)間8）pH值、aw和培養(yǎng)基的氧化還原電位9）所用的稀釋液類型10）食品樣品中有機(jī)體的相對(duì)數(shù)量11）競(jìng)爭(zhēng)或拮抗有機(jī)體的存在檢測(cè)食品中微生物總數(shù)的方法第12頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月顯微鏡菌落計(jì)數(shù)法

是通過(guò)顯微鏡對(duì)載玻片瓊脂層上生長(zhǎng)的微小菌落計(jì)數(shù)。首先進(jìn)行涂布，將0.1ml的牛乳瓊脂混合物涂布到4cm2的載玻片上，經(jīng)培養(yǎng)，干燥和染色，借助顯微鏡對(duì)微小菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。另一種方法是將2ml融化的瓊脂與2ml熱牛乳混合，隨后取0.1ml已經(jīng)接種的瓊脂涂抹到44cm2的載玻片上，最后用硫堇藍(lán)染色，用16mm物鏡的寬視野顯微鏡觀察載玻片。檢測(cè)食品中微生物總數(shù)的方法第13頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月最大可能數(shù)法

在這種方法中，食品樣品的稀釋液的準(zhǔn)備類似于SPC法。將三個(gè)連續(xù)等分量樣品或稀釋梯度的稀釋液轉(zhuǎn)移到9個(gè)或15個(gè)有適宜培養(yǎng)基的試管中，分別稱為3試管或5試管法。最初樣品中微生物的數(shù)量通過(guò)查閱標(biāo)準(zhǔn)MPN表來(lái)獲得。通常MPN法的結(jié)果高于SPC的結(jié)果。檢測(cè)食品中微生物總數(shù)的方法第14頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MPN法的優(yōu)點(diǎn)：（1）這種方法相對(duì)比較簡(jiǎn)單（2）與SPC法相比，不同實(shí)驗(yàn)室得到的結(jié)果更加可靠，相似率較高。（3）特殊微生物群體可以通過(guò)適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基進(jìn)行測(cè)定。（4）這是一種測(cè)定糞大腸桿菌群含量的方法。缺點(diǎn)：精確度低。檢測(cè)食品中微生物總數(shù)的方法第15頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月染色還原試驗(yàn)

在估測(cè)相關(guān)產(chǎn)品中活菌數(shù)量時(shí)，通常使用兩種染色劑：亞甲基藍(lán)和刃天青。進(jìn)行染色還原實(shí)驗(yàn)時(shí)，食品上清液加入任何一種染色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，亞甲藍(lán)會(huì)從藍(lán)色還原為白色，而刃天青則從暗藍(lán)色還原為粉紅色或白色，染色劑還原的時(shí)間與樣品中微生物的數(shù)量成正比。檢測(cè)食品中微生物總數(shù)的方法第16頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月染色還原試驗(yàn)刃天青還原反應(yīng)快速檢測(cè)牛肉腐敗，被還原為無(wú)色、有味、而且結(jié)果與SPC法顯著相關(guān)。乳品中用來(lái)估測(cè)鮮牛乳的微生物學(xué)質(zhì)量，簡(jiǎn)單，快捷，經(jīng)濟(jì)，而且只有活細(xì)胞才對(duì)顯色劑有明顯的還原能力。缺點(diǎn)：微生物對(duì)染色劑的還原程度不同，不適用于含還原酶的食品。第17頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月食品表面微生物的檢測(cè)1.棉拭/棉拭漂洗法是表面微生物檢驗(yàn)中最古老、應(yīng)用最廣泛的方法，它不僅應(yīng)用于食品及乳制品，而且還用于醫(yī)院、飯店。方法：將1.5ml液體加到平整的表面上，在3cm2區(qū)域內(nèi)擦拭15s，然后用微升移液管取0.1ml和0.5ml液體，將液體在平板計(jì)數(shù)瓊脂或選擇性培養(yǎng)基上涂布或倒平板計(jì)數(shù)。第18頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.接觸平板法

平板直接接觸復(fù)制微生物法（RODAC）使用一種特殊的皮氏培養(yǎng)皿，平板中傾倒15.5－16.5ml培養(yǎng)基，形成瓊脂平面；當(dāng)把平皿倒置時(shí)，凝固的瓊脂就會(huì)與待測(cè)表面直接接觸，接觸后蓋上平皿蓋、培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。缺點(diǎn)：僅適用于菌落較分散的表面，對(duì)于污染較嚴(yán)重的表面無(wú)效。食品表面微生物的檢測(cè)第19頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.瓊脂注射/瓊脂腸法瓊脂注射法：將1個(gè)100ml的注射器去掉針頭，改造成中空的柱體，并在中空的部分注入瓊脂，通過(guò)推動(dòng)活塞將瓊脂從柱體底部擠壓到待測(cè)表面上，將露在外面的那層切下，置于皮氏平皿中，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。瓊脂腸法：與注射法類似，只不過(guò)用的是塑料試管而不是改造的注射器。廣泛用于肉制品或食品加工設(shè)備表面微生物的檢測(cè)。缺點(diǎn)同RODAC法，適合菌落分散和表面污染程度較輕的樣品。食品表面微生物的檢測(cè)第20頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月其他檢測(cè)方法：1）直接表面檢測(cè)法2）粘性薄膜法3）棉拭/瓊脂斜面4）超聲波裝置5）噴霧槍法食品表面微生物的檢測(cè)第21頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)的獲得和傳統(tǒng)的鑒定方法微生物傳統(tǒng)的鑒定方法細(xì)菌：伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)（第八版1974、第九版1994）、伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)（第一版）1984~1989，2000年分五卷出版。放線菌：中國(guó)科學(xué)院微生物研究所編著的放線菌目分科、分屬檢索表真菌：Smith、Alexopoulos(阿歷克索鮑羅斯）、Ainsworth（安斯沃思）的分類系統(tǒng)第22頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)的獲得和傳統(tǒng)的鑒定方法伯杰氏手冊(cè)沿革：伯杰氏手冊(cè)自從1923年出版第1版，直至1974年第8版，均使用《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(Bergey′sManualofDeterminativeBacteriology)。1984年開始至1989年分四卷出版，并改名為《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(Bergey'sManualofSystematicBacteriology)(第一版)1994年又將"系統(tǒng)手冊(cè)"1-4卷中有關(guān)屬以上分類單元的分類鑒定資料進(jìn)行少量的修改補(bǔ)充后匯集成一冊(cè)仍用原來(lái)書名出版，故稱之為《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第九版第23頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)的獲得和傳統(tǒng)的鑒定方法第九版《伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》簡(jiǎn)介：內(nèi)容分四卷：第1卷：一般醫(yī)學(xué)和工業(yè)方面重要的革蘭氏陰性細(xì)菌。第2卷：放線菌以外的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。第3卷：古細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌及其他革蘭氏陰性細(xì)菌。第4卷:放線菌。

第24頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)的獲得和傳統(tǒng)的鑒定方法新的分類方法:數(shù)值分類、核酸在細(xì)菌分類中的應(yīng)用、遺傳學(xué)方法、血清學(xué)和化學(xué)分類等。鑒定方法的革新。新版在表型特征基礎(chǔ)上，以DNA資料對(duì)屬、種的分類地位給予決定性的判斷。將DNA中G+Cmol％含量的測(cè)定、DNA雜交、RNA寡核苷酸的順序分析、細(xì)胞化學(xué)分析、數(shù)值分類等方法應(yīng)用到細(xì)菌的分類學(xué)上。第25頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)的獲得和傳統(tǒng)的鑒定方法應(yīng)用原則查閱相關(guān)盡可能的資料每一步利用常識(shí)、結(jié)果判定最少的試驗(yàn)，最好的結(jié)果第26頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)的獲得和傳統(tǒng)的鑒定方法鑒定步驟菌株的純化化能自養(yǎng)菌、光合菌or化能異養(yǎng)菌的確定根據(jù)分離的過(guò)程確定形態(tài)、Gram、Spore的確定色素等專一特性碳源的類型、氧化性、發(fā)酵性歸屬；由屬的特征選擇試驗(yàn)；進(jìn)一步確定第27頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)的獲得和傳統(tǒng)的鑒定方法應(yīng)用實(shí)例（a-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離、鑒定、保存）第一步：菌落純菌株的獲得第二步：設(shè)計(jì)一系列的檢測(cè)反應(yīng)第三步：對(duì)照結(jié)果定名第四步：保存生化反應(yīng)平板篩選：“抑制圈和顯色圈法”。第28頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法1.DNA同源性和DNA中（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)（G+C)%=（G+C)/(A+T+C+G)%Tm法（熱變溫度法）測(cè)定菌株間相差2.5～4.0％；種間相差5～10％以上；屬間相差10％以上第二節(jié)食品微生物學(xué)的現(xiàn)代鑒定方法第29頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月每個(gè)生物種都有特定的GC%范圍，因此可以作為分類鑒定的指標(biāo)。細(xì)菌的GC%范圍為25--75%，變化范圍最大，因此更適合于細(xì)菌的分類鑒定。第30頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

GC%測(cè)定主要用于對(duì)表型特征難區(qū)分的細(xì)菌作出鑒定，并可檢驗(yàn)表型特征分類的合理性，從分子水平上判斷物種的親緣關(guān)系。G+C含量的比較主要用于分類鑒定中的否定但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它們之間具有近的親緣關(guān)系。第31頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

同一個(gè)種內(nèi)的不同菌株G+C含量差別應(yīng)在4～5%以下；同屬不同種的差別應(yīng)低于10～15%；

G+C含量已經(jīng)作為建立新的微生物分類單元的一項(xiàng)基本特征，它對(duì)于種、屬甚至科的分類鑒定有重要意義。

若二個(gè)在形態(tài)及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差別大于5%，則肯定不是同一個(gè)種，大于15%則肯定不是同一個(gè)屬。第32頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)的現(xiàn)代鑒定方法1.DNA同源性Southernblotting（DNA-DNA)Northernblotting(DNA-RNA)Westernblotting(Pro-Anti)Easternblotting

第33頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)的現(xiàn)代鑒定方法2.23S、16S、5SrRNA序列相似性核糖體70S

30S50S

16S213423S+5S蛋白質(zhì)第34頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)的現(xiàn)代鑒定方法16S亞基保守性高，是細(xì)菌進(jìn)化的計(jì)時(shí)器普遍存在細(xì)胞RNA含量較高rRNA穩(wěn)定16sRNA序列保守16sRNA分子量適中16SrRNA基因約含有1540個(gè)核苷酸，分可變區(qū)和保守區(qū)，不同微生物可變區(qū)核苷酸序列不同，從而可以利用這些特異性序列進(jìn)行微生物的鑒定；

第35頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/9/1636

細(xì)

菌

域

Domainbacteria

古（生）菌域

Domainarchaea

真

核

生

物

域

Domaineukaryota

紫色細(xì)菌

線粒體

甲烷球菌屬

甲烷桿菌屬

真菌

植物

葉綠體

革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌

甲烷八疊球菌屬

極端嗜鹽菌

動(dòng)物

藍(lán)細(xì)菌

無(wú)硫綠細(xì)菌

熱球菌屬

偽變形蟲

纖毛蟲

黃桿菌

棲熱胞菌屬

熱網(wǎng)菌屬

熱變形細(xì)菌

粘菌

鞭毛蟲

產(chǎn)液菌屬

微孢子

毛滴蟲

雙滴蟲（假滴蟲屬）

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生物總系統(tǒng)發(fā)育樹（根據(jù)16SrRNA序列比較繪制，引自《布氏微生物學(xué)》2000）第36頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)的現(xiàn)代鑒定方法具體測(cè)定方法：采用RNaseT1酶可以將16SrRNA酶解在G位點(diǎn)上切割，得到6～20個(gè)堿基大小的序列對(duì)這些6～20堿基片段進(jìn)行分離、測(cè)序比較不同微生物之間SAB（Dice型相關(guān)系數(shù)）的相似性。

第37頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)的現(xiàn)代鑒定方法SAB=2×NAB/（NA+NB）NAB代表兩菌所含相同寡核苷酸的堿基總數(shù)，NA和NB分別代表兩菌寡核苷酸所含堿基總數(shù)SAB等于1，說(shuō)明所比較的兩菌株rRNA序列相同，是同一進(jìn)化時(shí)間的微生物，若SAB值小于0.1，兩菌親緣關(guān)系很遠(yuǎn)第38頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)的現(xiàn)代鑒定方法分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用核酸探針技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)（PCR技術(shù)）基因芯片技術(shù)第39頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/9/1640

核酸探針技術(shù)原理：兩條不同來(lái)源的核酸鏈如果具有互補(bǔ)的堿基序列，就能夠特異性的結(jié)合而成為分子雜交鏈。據(jù)此，將己知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法標(biāo)記，加入己變性的被檢DNA樣品中，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的DNA區(qū)段形成雜交雙鏈，從而達(dá)到鑒定樣品中DNA的目的。

這種能認(rèn)識(shí)到特異性核苷酸序列有標(biāo)記的單鏈叫DNA分子核酸探針或基因探針。

第40頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

制備核酸探針要注意兩個(gè)關(guān)鍵性的問(wèn)題：1.要選擇特異性強(qiáng)而又無(wú)交叉反應(yīng)的核酸(DNA或RNA)片段，可通過(guò)核酸重組和克隆以及人工合成、PCR擴(kuò)增等技術(shù)獲得2.標(biāo)記物，當(dāng)前常用同位素(32P、35S等）、光生物素及地高辛(digoxigenin)標(biāo)記。核酸探針技術(shù)已被用于檢驗(yàn)食品中一些常見的病原菌。如產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌、沙門氏菌。第41頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/9/1642

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱為無(wú)細(xì)胞克隆系統(tǒng)，是1985年由Mullis創(chuàng)建的一項(xiàng)DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。PCR的全過(guò)程由變性（denature）、退火（annealing）和延伸（extension）三步組成的若干個(gè)循環(huán)，每步之間通過(guò)溫度的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)換。其基本原理是在體外對(duì)一特定的雙鏈DNA片段（或稱靶DNA)進(jìn)行高效擴(kuò)增。首先將靶DNA雙鏈加熱變性為單鏈，然后加入兩段人工合成的與靶DNA兩端鄰近序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段作為引物(primer)，即左端引物和右端引物，該對(duì)引物與互補(bǔ)的DNA單鏈堿基互補(bǔ)結(jié)合后，在有DNA多聚酶和四種dNTPs底物存在的情況下，引物沿模板DNA鏈（靶DNA單鏈）按5’→3’方向延伸，自動(dòng)合成新的DNA雙鏈。第42頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/9/1643

PCR技術(shù)有快速、特異、敏感等特點(diǎn)，因而該技術(shù)在食品中致病菌的檢測(cè)方面具有很大的應(yīng)用潛力。PCR技術(shù)能快速地檢出肉食品中的沙門氏菌，檢測(cè)的敏感性和特異性均為100%，保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。PCR還可用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定，它是在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？捎糜谕瑫r(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染。第43頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/9/1644基因芯片（genechip）又稱DNA微陣列（DNAmicroarray），是指將許多特定的寡居核苷酸片斷或基因片段作為探針，有規(guī)律的排列固定于支持物上形成的DNA分子陣列。芯片與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交后，在通過(guò)激光共聚焦熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)等對(duì)其表面進(jìn)行掃描即可獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。由于該技術(shù)同時(shí)將大量的探針固定于支持物上，所以可以一次性對(duì)大量序列進(jìn)行檢測(cè)和基因分析，解決了傳統(tǒng)的核酸印跡雜交（southernblot和northernblot等）操作復(fù)雜，操作序列數(shù)量少等缺點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)的突出特點(diǎn)在于其高度的并行性、多樣化、微型化和自動(dòng)化，以及靈敏、高效和低成本等優(yōu)點(diǎn)。第44頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)的現(xiàn)代鑒定方法3.寡核苷酸種類4.可溶性蛋白質(zhì)總量或形態(tài)學(xué)、生理生化特征的數(shù)值分類法5.細(xì)胞壁分析6.血清反應(yīng)法7.細(xì)胞脂肪酸組成分析第45頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法1.化學(xué)方法熱穩(wěn)定性核酸酶法（金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus））鱟試劑法（Limulusamoebocytelysate（LAL）assay）（適用于G-細(xì)菌）ATP測(cè)定法（適用于活細(xì)胞）輻射線測(cè)定法熒光或發(fā)色測(cè)定法第三節(jié)食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)第46頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.化學(xué)方法1）熱穩(wěn)定性核酸酶法（金黃色葡萄球菌（S.aureus））

通過(guò)測(cè)定食物中的熱穩(wěn)定性核酸酶可以檢測(cè)出食物中存在的大量的金黃色葡萄球菌。這是由于其產(chǎn)生熱穩(wěn)定性核酸酶以及凝固酶。研究表明：有0.34單位的熱穩(wěn)定性核酸酶存在時(shí)，表明有某種金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，而此時(shí)腸毒素的含量還不會(huì)導(dǎo)致食物中毒。0.34單位的熱穩(wěn)定性核酸酶相當(dāng)于金黃色葡萄球菌產(chǎn)生9.5×10－3ug腸毒素。熱穩(wěn)定性核酸酶檢測(cè)法可以作為指示金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的方法。第三節(jié)食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)第47頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.化學(xué)方法

2）鱟試劑法鱟試劑法又稱鱟變形細(xì)胞溶解物實(shí)驗(yàn)。革蘭氏陰性菌可通過(guò)產(chǎn)生的內(nèi)毒素進(jìn)行鑒定，內(nèi)毒素是由菌體外膜裸露的脂多糖和被外膜包圍的脂A構(gòu)成的。鱟變形細(xì)胞溶解物實(shí)驗(yàn)采用來(lái)自馬蹄蟹血液的血細(xì)胞溶菌蛋白。溶菌蛋白是已知的對(duì)內(nèi)毒素最敏感的物質(zhì)。鱟實(shí)驗(yàn)是在少量的溶菌液中加入食物懸液或其他待測(cè)樣品，并在37℃培養(yǎng)1h。內(nèi)毒素的存在會(huì)導(dǎo)致胞溶物凝膠。鱟試劑能檢出1.0pg脂多糖。由于大腸桿菌含有3.0fg脂多糖，所以能檢出＜300個(gè)革蘭氏陰性菌。第48頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月鱟試劑法鱟試劑法首次應(yīng)用于食品檢驗(yàn)是檢測(cè)碎牛肉中的腐敗菌。內(nèi)毒素的滴定度隨著革蘭氏陰性細(xì)菌數(shù)量的增加而增加。由于冷藏鮮肉的變質(zhì)通常是由革蘭氏陰性菌引起的，所以鱟試劑法是快速檢測(cè)革蘭氏陰性菌總菌數(shù)的好方法。這種方法適合于評(píng)價(jià)巴氏殺菌前后乳的大腸菌群衛(wèi)生質(zhì)量。第49頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3）ATP法ATP在細(xì)胞死亡2h后消失，并且每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中的ATP含量恒定，每個(gè)細(xì)胞約含有10－18－10－17mol，相當(dāng)于105cfu的細(xì)菌含有4×104mol/LATP。一種最簡(jiǎn)單的ATP測(cè)定法之一是利用螢火蟲的蟲熒光素－熒光素酶系統(tǒng)測(cè)定。在ATP存在時(shí)，用熒光檢測(cè)器檢測(cè)熒光素酶發(fā)射的熒光強(qiáng)度。螢火蟲熒光素的發(fā)光量與添加的ATP量成正比。在106－109cfu/g范圍內(nèi)，微生物的ATP含量和細(xì)菌數(shù)呈線性關(guān)系。ATP法已經(jīng)用于雞肉、豬肉和牛肉的檢測(cè)。（cfu/mL指的是每毫升樣品中含有的細(xì)菌群落總數(shù)）第50頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章食品微生物鑒定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)的現(xiàn)代鑒定方法4）輻射測(cè)定法

利用培養(yǎng)基中14C標(biāo)記的代謝物為基礎(chǔ)，當(dāng)微生物利用這些物質(zhì)時(shí)，釋放14CO2并用放射能計(jì)數(shù)器檢測(cè)。

14C標(biāo)記的葡萄糖。對(duì)那些不能利用葡萄糖的微生物，14C標(biāo)記的甲酸鹽或14C標(biāo)記的谷氨酸鹽。第51頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4）輻射測(cè)定法整個(gè)程序如下：向15ml帶蓋的血清瓶中加入12－36ml含標(biāo)記代謝物的