生化分離大題

1、c簡述純水的制備工藝1） 樹脂：陽樹脂（強(qiáng)酸性X陰樹脂（強(qiáng)堿或弱堿，弱堿不能除去弱酸性陰離子硅酸，碳酸）2） 串聯(lián)床：強(qiáng)酸-弱堿、強(qiáng)酸-強(qiáng)堿-弱酸、強(qiáng)酸-弱堿-強(qiáng)酸-強(qiáng)堿、強(qiáng)酸-強(qiáng)堿-混合床3） 混床可以看成是由許多陰、陽離子交換樹脂交錯(cuò)排列而成的多級(jí)式復(fù)床。一般混床采用強(qiáng)酸陽離子交換樹脂和強(qiáng)堿陰離子交換樹脂。特點(diǎn)：脫鹽效果好、避免脫鹽過程中pH變化、再生不方便2、層析分離的基本原理：利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同的程度分布在兩個(gè)相中的物理方法。根據(jù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的分類：低壓層析技術(shù)、中壓層析技術(shù)、高壓層析技術(shù)電泳法根據(jù)固定相的形狀不同的分類：柱層析法、紙層析法、薄層層析法 根據(jù)流動(dòng)相的物態(tài)不同的分類汽相層析法、液相層析法、固相層析法層析的分類:：根據(jù)作用機(jī)理不同分：吸附層析法、分配層析法、凝膠過濾法3、 c錯(cuò)流過濾|：又稱切向流過濾，在壓力推動(dòng)下，懸浮液以高速在管狀濾膜的內(nèi)壁作切向流動(dòng)，利用流動(dòng)的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走，而附著在濾膜上的濾餅很薄，因而能在長時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定不變的過濾速度4、 錯(cuò)流過濾特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：收率高、質(zhì)量好、減少處理步聚、染菌罐也能進(jìn)行處理缺點(diǎn)：介質(zhì)阻力大、不能得到干濾餅5、 CO2超臨界萃取的優(yōu)點(diǎn)：|臨界條件溫和；產(chǎn)品分離簡單；優(yōu)良的傳質(zhì)性能;擴(kuò)散系數(shù)大；粘度低；無毒、無害、無腐蝕、不燃；價(jià)格便宜；根據(jù)分離目的可獲得萃取物、萃余物。6、 |蛋白質(zhì)的溶解模型：（|1）水殼模型：蛋白質(zhì)位于水池的中心，周圍存在的水層將其與反膠束壁隔開；（2）半島模型：pro表面存在強(qiáng)烈疏水區(qū)，該區(qū)直接與有機(jī)相接觸。（3）pro吸附于反膠束內(nèi)壁（4）pro疏水區(qū)與幾個(gè)反膠束的S疏水尾發(fā)生相互作用，被幾個(gè)小反膠束所“溶解”。7、 蛋白質(zhì)電泳常用的方法有哪些？（一） 紙電泳 指用濾紙作為支持載體的電泳方法。是最早使用的區(qū)帶電泳。（二） 醋酸纖維素薄膜電泳電泳時(shí)經(jīng)過膜的預(yù)處理、加樣、電泳、染色、脫色與透明即可得到滿意的分離效果。此電泳的特點(diǎn)是分離速度快、電泳時(shí)間短、樣品用量少。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。（三） 凝膠電泳以凝膠物質(zhì)作支持物進(jìn)行電泳的方式，被稱為凝膠電泳。普通的凝膠電泳在板上進(jìn)行，以凝膠作為介質(zhì)。電泳中常用的凝膠為葡聚糖、交聯(lián)聚丙烯酰胺和瓊脂糖（四） 等電聚焦電泳等電聚焦電泳過程一種利用有pH值梯度的介質(zhì)，分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。（五） 等速電泳采用兩種不同濃度的電解質(zhì)組成，一種為前導(dǎo)電解質(zhì)，充滿整個(gè)毛細(xì)管柱；另一種為尾隨電解質(zhì)，置于一端的電泳槽中。（六） 雙向凝膠電泳（二維電泳）（七）免疫電泳免疫電泳是瓊脂平板電泳和雙相免疫擴(kuò)散兩種方法的結(jié)合。8、 f反膠束應(yīng)用于蛋白質(zhì)萃取的優(yōu)點(diǎn)|：①有很高的萃取率和反萃取率并具有選擇性；②分離、濃縮可同時(shí)進(jìn)行，過程簡便；③能解決蛋白質(zhì)（如胞內(nèi)酶）在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問題；④表面活性劑往往具有細(xì)胞破壁功效，可直接從完整細(xì)胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶；⑤成本低，溶劑可反復(fù)使用等。需要大的膜面積、目前適用于小分子的分離。9、 f防止膜污染的方法：①進(jìn)料液的預(yù)處理：預(yù)過濾、pH及金屬離子控制；②選擇合適的膜材料：減輕膜的吸附；③改善操作條件：加大流速。110、g高表達(dá)產(chǎn)生的積聚物在細(xì)胞內(nèi)部形成不溶物原因?蛋白過量積聚，超過溶解度，導(dǎo)致沉淀;蛋白生成太快，分子間疏水基團(tuán)相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子內(nèi)部二硫鍵的錯(cuò)誤連接導(dǎo)致沉淀；表達(dá)蛋白過多，與其結(jié)合/誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài)11、 g固液分離的方法有哪些？各有何優(yōu)缺點(diǎn)。過濾filtration過濾操作是借助于過濾介質(zhì)，在一定的壓力差A(yù)P作用下，使懸浮液中的液體通過介質(zhì)的孔道，而固體顆粒被截留在介質(zhì)上，從而實(shí)現(xiàn)固液分離的單元操作。離心應(yīng)用（1）難過濾的發(fā)酵液：對(duì)于濃度較小，粒徑較大，硬度較強(qiáng)的不溶物，可以采用過濾分離。忌用助濾劑、或助濾劑無效的懸浮液。（2）互不相溶液一液分離液液萃?。?）不同密度固體或乳濁液的密度梯度分離超：離心分離。缺點(diǎn)：（1）分離得到的不是濾餅一樣的半干物，而是漿狀物；（2）處理量?。?）設(shè)備復(fù)雜，價(jià)格貴，分離成本高。膜分離membraneseparation用半透膜作為選擇障礙層，利用膜的選擇性（孔徑大?。阅さ膬蓚?cè)存在的能量差作為推動(dòng)力，允許某些組分透過而保留混合物中其它組分，從而達(dá)到分離目的的技術(shù)。膜分離的特點(diǎn)①操作在常溫下進(jìn)行；②是物理過程，不需加入化學(xué)試劑；③不發(fā)生相變化（因而能耗較低）；④在很多情況下選擇性較高；⑤濃縮和純化可在一個(gè)步驟內(nèi)完成；⑥設(shè)備易放大，可以分批或連續(xù)操作。雙水相萃取ATPS利用物質(zhì)在不相溶的，兩水相間分配系數(shù)的差異進(jìn)行萃取的方法。又稱雙水相分配法特點(diǎn)（1）保留產(chǎn)物活性。（2）不存在相的分離。（3）溶液分相不依賴有機(jī)溶劑。（4）固液分離。12、 j基因工程包涵體的純化方"收集菌體細(xì)胞一細(xì)胞破碎一包涵體的洗滌…目標(biāo)蛋白的變性溶解…目標(biāo)蛋白的復(fù)性13、 l離子交換層析機(jī)理|：通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離純化的方法。分五個(gè)步驟：（1）開始在樹脂中加入樣品，；（2）樹脂與樣品進(jìn)行吸附;（3）加入解吸劑使其解吸;（4）解吸結(jié)束后加入再生劑；（5）樹脂再生。14、 l林可霉素性質(zhì)：堿性抗生素，分子中有一個(gè)胺基pK=7?6；pH<2?0的溶液中不穩(wěn)定；鹽酸鹽易溶于水，游離堿在水中溶解度較小，易溶于有機(jī)溶劑，如醇類（甲醇、乙醇、異丙醇、、丁醇）；酯類（乙酯，丁酯）；酮類（丙酮、甲乙酮）等，醇類中溶解性比酯和酮類中好。（1） .設(shè)計(jì)提取工藝路線:能否用萃取法提??？選用什么溶劑最好？理由？萃取時(shí)pH范圍？欲提高分配系數(shù)，可采取什么措施？如需進(jìn)一步反萃取，考慮反萃取的pH范圍。原因？（2） .若采用二級(jí)逆流萃取，a=3,K0=15.56，求萃取的理論收率。1.a.萃取法適用于弱酸弱堿性物質(zhì)Lin—pK=7.6弱堿性物質(zhì)，不同形態(tài)時(shí)溶解度不同。選丁醇，原因：①醇類中溶解度最大②丁醇C鏈長，與水互溶度小。pH>7.6，Lin游離分子濃度f當(dāng)pH10.0時(shí),C0=99.6%C+=0.4%.\選pH10pH再升高是否更好？Lin幾乎都呈游離分子，溶解度不會(huì)再增大；且耗堿量多被同時(shí)萃取的堿性雜質(zhì)f,分離效率ILin穩(wěn)定性受影響

加NaCl,鹽析作用:①水中溶解度進(jìn)一步IKf(18—28)②兩相互溶度I易分層。反萃pH:2.0<pH<7.6原因pH<7.6:Lin電離度大“+”易溶于水pH>2.0:Lin穩(wěn)定性。2.二級(jí)逆流萃取a=3 K0=15.56甲一E一K_1+10注-沖_1+10注-沖1556 =1551+10’T?！龅膬?yōu)點(diǎn)：的優(yōu)點(diǎn)：可應(yīng)用于(1)難過濾的發(fā)酵液(2)互不相溶液一液分離液液萃取(3)，濁液的密度梯度分離超缺點(diǎn)：(1)分離得到的不是濾餅一樣的半干物，15、 L離心分離L-不同密度固體或乳而是漿狀物；(2)處理量??；(3)設(shè)備復(fù)雜，價(jià)格貴，分離成本高。16、l掌握離子交換的基本步驟 .一樹脂的選擇' I 匚II.?交聯(lián)度的選擇 根據(jù)生化物質(zhì)分子量考慮。 、’,原則：在不影響交換容量的前提下盡量增大交聯(lián)度。I樹脂的型式：陽樹脂：H型、鹽型(Na+NH4+)陰樹脂：OH型、鹽型(Cl—)。樹脂預(yù)處理-物理處理：水洗?、過,篩，去雜，以獲得粒度均勻的樹脂顆粒；-化學(xué)處理：轉(zhuǎn)型陽離子樹脂酸一堿一酸陰離子樹脂堿一酸一堿最后以去離子水或緩沖液平衡離子交換吸附溶液中待交換離子與樹脂上的活性離子發(fā)生交換反應(yīng)的過程，使盡可能多的待交換離子吸附到樹脂上，同時(shí)保證其選擇性洗脫洗脫一般采取梯度淋洗：先采用洗脫能力弱的溶液，使易洗脫組分流出，然后依次使用洗脫能力更強(qiáng)的溶液，洗脫較難洗脫的組分?？梢酝ㄟ^1)改變?nèi)芤簆H值2)改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度再生離子交換樹脂(IONRESIN)使用一段時(shí)間后，吸附的雜質(zhì)接近飽和狀態(tài)，就要進(jìn)行再生處理，使之恢復(fù)原來的組成和性能17、 m膜分離的特點(diǎn)：①操作在常溫下進(jìn)行；②是物理過程，不需加入化學(xué)試劑；③不發(fā)生相變化(因而能耗較低)；④在很多情況下選擇性較高；⑤濃縮和純化可在一個(gè)步驟內(nèi)完成；⑥設(shè)備易放大，可以分批或連續(xù)操作。18、 n濃差極化-凝膠層模型:當(dāng)發(fā)生濃差極化后，膜面上濃度Cw大于主體濃度Cb，溶質(zhì)向主體反擴(kuò)散；當(dāng)溶質(zhì)向膜面的流動(dòng)速度與反擴(kuò)散速度達(dá)到平衡時(shí)，在膜面附近存在一個(gè)穩(wěn)定的濃度梯度區(qū)，這一區(qū)域稱為濃度極化邊界層；在邊界層中取一微元薄層，對(duì)此微元薄層作物料衡算。推導(dǎo)邊界層形成后，通量與Cw及Cb的關(guān)系。|19、m膜污染的表現(xiàn)：|一是膜通量下降；二是通過膜的壓力和膜兩側(cè)的壓差逐漸增大；三是膜對(duì)生物分子的截留性能改變。m膜污染的清洗方法：|物理法：海綿球擦洗、熱水法、反沖洗和循環(huán)清洗化學(xué)法：選擇清洗劑要注意三點(diǎn)：1.要盡量判別是何種物質(zhì)引起污染；2.清洗劑要不致于對(duì)膜或裝置有損害;3.要符合產(chǎn)品要求?；瘜W(xué)法常用的清洗劑有：NaOH、酸、表面活性劑、氧化劑、酶、有機(jī)溶劑20、pH對(duì)表觀分配系數(shù)的影響(pH~K)：]pH低有利于酸性物質(zhì)分配在有機(jī)相，堿性物質(zhì)分配在水相。對(duì)弱酸隨pHlKf,當(dāng)pH<<pK時(shí)，K-K0由萃取機(jī)理和k~ph的關(guān)系可得出如下結(jié)論：酸性物質(zhì)堿性物質(zhì)萃取pH<pKpH>pK反萃取pH>pKpH<pK控制pH,去除雜質(zhì)：⑴堿性雜質(zhì) pKpen<pK堿雜 當(dāng)pH<pKpen(2.75)pH<<pK堿雜堿性雜質(zhì)呈正離子狀態(tài)，易溶于水相中，..?自然分離除去(2)酸性雜質(zhì)pK酸雜<pKpen pH控制:pK酸雜負(fù)離子(3)酸性雜質(zhì) pK酸雜>pKpen21、p選擇破碎方法的依據(jù)：|細(xì)胞處理量;細(xì)胞壁強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)(高聚物交聯(lián)程度、種類和壁厚度)；目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)破碎條件的敏感性；破碎程度；目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放22、q為什么青霉素在酸性(pHW2.5)條件下，而紅霉素卻要在堿性(pHN9.8)條件下才能被萃取到丁酯中去呢？_青霉素 紅霉素酸堿性pHvpKpH>pK弱酸性(2.75) 弱堿性(9?4)游離分子 “+”“-” 游離分子根據(jù)表觀分配系數(shù)公式可知，弱酸的表觀分配系數(shù)：K=K0/(1+10pH—pK)弱酸的表觀分配系數(shù)：K=K0/(1+10pK—pH)對(duì)于弱酸：pH<pK時(shí)，分配系數(shù)大對(duì)于弱堿：pH>pK時(shí)，分配系數(shù)大不同pH條件影響弱電解質(zhì)電離，從而影響分子的極性，根據(jù)相似相溶原則，在弱極性的丁酯中極性小的分子溶解度比水中大，故從水相轉(zhuǎn)入丁酯相中，而發(fā)酵液中存在的其它雜質(zhì)由于極性情況與抗生素不同，故很少進(jìn)入丁酯中，這樣就達(dá)到一定程度的純化。23、q將青霉素由水相萃取到丁酯相中，其pK=2?75，萃取條件：pH=2?5,T=10°C，VF：VS=1：1，測得萃取前發(fā)酵液(水相)效價(jià)20000u/ml，平衡后廢液效價(jià)645?2u/ml，求分配系數(shù)K和K0。青霉素為弱酸性電解質(zhì)：k0=萃取相濃度/萃余相濃度=31弱酸的表觀分配系數(shù)：K=K0/(1+10pH-pK)=11.16R24、溶解一擴(kuò)散模型:認(rèn)為膜是均勻的，無孔，水和溶質(zhì)分兩步通過膜：第一步：首先吸附溶解到膜材質(zhì)表面上；第二步：在膜中擴(kuò)散傳遞(推動(dòng)力為化學(xué)位梯度)，擴(kuò)散是控制步驟，服從Fick定律，推導(dǎo)出溶劑和溶質(zhì)透過膜的速度公式25、s生物技術(shù)下游加工過程的選擇準(zhǔn)則：|(1)盡可能簡單、低耗、高效、快速（2）采用步驟應(yīng)最少（3）避免同一原理的多次出現(xiàn)（4）盡量減少新化合物的進(jìn)入待分離的溶液（5）合理的分離步驟次序26、生物技術(shù)下游加工過程的發(fā)展動(dòng)向:①基礎(chǔ)理論研究：選擇性分離劑、數(shù)學(xué)模型②應(yīng)用研究：提高分離過程選擇性、開發(fā)新介質(zhì)、提高分離純化技術(shù)③工程問題研究④改善環(huán)境相容性S27、|雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用|：1）目前較多地應(yīng)用于胞內(nèi)酶的提取和精制上。2）.用雙水相萃取技術(shù)處理細(xì)胞勻漿液，既可方便地除去細(xì)胞碎片，還可使酶得到精制。通常將目的蛋白質(zhì)分配在上相（PEG），而細(xì)胞碎片分配在下相（鹽）。3）.萃取操作時(shí)單位重量相系統(tǒng)中勻漿液的加入量一般每1kg萃取相系統(tǒng)以處理200?400g濕菌體為宜。28、x細(xì)胞破碎技術(shù)：（1）機(jī)械破碎：搗碎法、研磨法、勻漿法、超聲法（2）物理破碎：溫度差破碎法、壓力差破碎法（3）化學(xué)破碎：有機(jī)溶劑、表面活性劑、劑酸堿4）酶促破碎：自溶法、外加酶制劑法29、x吸附的類型有哪些？固定床吸附：固定床吸附是吸附分離操作中常采用的設(shè)備.膨脹床吸附：膨脹床是發(fā)展中的吸附分離技術(shù).在蛋白質(zhì)類生物大分子的單步純化分離過程有著誘人的開發(fā)潛力.特點(diǎn)：1）兼有固定床和流化床的優(yōu)點(diǎn)，流化的固相介質(zhì)基本可以懸浮在床內(nèi)的固定位置，流體流動(dòng)狀態(tài)以平推流的方式流經(jīng)床層.2）集料液澄清、目標(biāo)產(chǎn)物濃縮和分離純化為一體的生物集成分離技術(shù).還有鹽析吸附、離子交換吸附、親和吸附、染料配位體吸附、免疫吸附、固定金屬螯合吸附、羥基磷灰石吸附Y(jié)30、預(yù)處理的目的：|⑴改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，包括增大懸浮液中固體粒子的尺寸，降低液體黏度。促進(jìn)從懸浮液中固形物的分離速度，提高固液分離的效率。⑵相對(duì)純化，去除發(fā)酵液