異硫氰酸胍玻璃粉法提取病毒rna的研究

異硫氰酸胍玻璃粉法提取病毒rna的研究

冠狀病毒是一種嚴(yán)重的急性呼吸綜合征（ss）的病原體。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)在感染早期即可檢測到病毒RNA,是SARS早期診斷的首選方法。為了提高檢出率,國內(nèi)外一般采用QIAGEN公司生產(chǎn)的病毒RNA提取試劑盒,該試劑盒價(jià)格非常昂貴,很難在臨床上常規(guī)應(yīng)用。我們建立了一種快速簡便提取SARS冠狀病毒RNA的方法,現(xiàn)報(bào)道如下。1材料和方法1.1總rna提取24例SARS患者均為北京某醫(yī)院的住院患者,發(fā)病時(shí)間為5～20d,同時(shí)采集患者糞便和痰液。將1g糞便溶于1ml生理鹽水中,振蕩混勻,5000r/min離心10min,取上清提取病毒RNA。痰液加等量10g/L乙酰半胱氨酸,室溫振蕩1h,充分液化后提取病毒RNA。臨床標(biāo)本的前期處理和病毒RNA的提取均在BSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。1.2tri能力有析具體操作步驟如下:(1)在0.1ml標(biāo)本液中加入異硫氰酸胍-玻璃粉裂解液(4.7mol/L異硫氰酸胍,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HClpH6.4,1%TritonX-100和玻璃粉10g)0.9ml,混勻,室溫作用10min,6000×g離心1min。(2)棄上清,加異硫氰酸胍漂洗液(4.7mol/L異硫氰酸胍和100mmol/LTris-HClpH6.4)1ml,混勻后6000×g離心1min。(3)棄上清,加70%乙醇1ml,混勻后6000×g離心1min。(4)棄上清,將塑料離心管倒置,37℃烤干10～15min。(5)加入DEPC處理的去離子水50μl洗脫RNA,振蕩混勻后6000×g離心1min,取上清即可作為RT-PCR的模板。1.3過濾柱的添加操作按照說明書進(jìn)行,具體操作步驟如下:(1)在1.5ml塑料離心管中加入AVL560μl,然后加入標(biāo)本液140μl,混勻后室溫作用10min。(2)加入無水乙醇560μl。(3)混勻后分兩次加入過濾柱中,每次加630μl,8000r/min離心1min。(4)加入AW1液500μl,8000r/min離心1min。(5)加入AW2液500μl,14000r/min離心3min。(6)最后加入60μlAVE液,8000r/min1min將RNA洗脫下來作為模板用于PCR擴(kuò)增。1.4rt-pcr1.4.1離心條件下dntp1l在Eppendorf管中加入9μl病毒RNA提取液和1μl引物BNIoutAs(引物序列均為WHO公布序列,參見文獻(xiàn)1),95℃3min,4℃1min,離心后加入5×FirstStrandBuffer4μl、0.1mol/LDTT2μl、10mmol/LdNTP1μl、RNA酶抑制劑1μl、SuperscriptⅡ1μl、去離子水1μl,42℃45min,75℃7min。1.4.2niss2和bniss3反應(yīng)體系:10×緩沖液2μl、2.5mmol/LdNTP1μl、引物BNIoutS2和BNIoutAS各1μl、Taq酶1U、cDNA2μl、去離子水12.8μl。反應(yīng)條件:95℃3min,94℃40s,54℃40s,72℃40s,35個(gè)循環(huán),72℃延伸3min。1.4.3pcrpcr反應(yīng)體系:10×緩沖液2μl、2.5mmol/LdNTP1μl、引物BNIinS和BNIinAS各1μl、Taq酶1U、第一輪PCR產(chǎn)物2μl、去離子水12.8μl。反應(yīng)條件:同第一輪PCR。1.4.4結(jié)果分析第二輪PCR產(chǎn)物在含EB的10g/L瓊脂糖凝膠中電泳,紫外分析儀下觀察結(jié)果,在109bp處出現(xiàn)特異條帶為陽性。2結(jié)果2.1不同清洗時(shí)間對從異硫氰酸脫水物中提取病毒rna的影響表1顯示室溫和80℃兩種洗脫溫度下RT-PCR檢出率的差別,所有在室溫時(shí)陽性的糞便和痰液標(biāo)本在80℃時(shí)也均陽性。2.2異硫氰酸凝膠法與齊格納試劑盒rt-pcr的檢出率之比采用異硫氰酸胍-玻璃粉提取法陽性的糞便和痰液標(biāo)本采用QIAGEN試劑盒提取后也均陽性(見表2)。3洗脫溫度和時(shí)間為了提高SARS冠狀病毒RNA的PCR檢出率,除采用套式PCR和熒光標(biāo)記引物等措施外,另一個(gè)重要措施就是采用靈敏可靠的病毒RNA提取方法。QIAGEN公司生產(chǎn)的病毒RNA提取試劑盒昂貴的價(jià)格限制了其在我國臨床上的推廣應(yīng)用。本文參考國內(nèi)外一些相關(guān)文獻(xiàn),建立了異硫氰酸胍-玻璃粉法提取SARS冠狀病毒RNA的方法,研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)增加洗脫溫度可以提高病毒核酸的檢出率。采用此方法與QIAGEN公司生產(chǎn)的病毒RNA提取試劑盒平行檢測了24例SARS患者的糞便和痰液標(biāo)本,結(jié)果顯示兩種方法的RT-PCR陽性率基本相同,前者略低于后者。Rasool等人報(bào)道的研究方法是分兩次洗脫病毒核酸,將兩次洗脫液合并后使用乙酸銨和乙醇沉淀后再用DEPC處理水溶解。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)洗脫液進(jìn)一步采用乙酸銨和乙醇沉淀后可以提高病毒核酸檢出率。郭乃洲等人的研究結(jié)果也證實(shí)異硫氰酸胍裂解異丙醇沉淀法操作簡單,具有較好的敏感性和特異性。異硫氰酸胍-玻璃粉法的成本明顯低于QIAGEN試劑盒,僅為QIAGEN試劑盒的十分之一,操作時(shí)