線粒體基因組的序列分析

線粒體基因組的序列分析

人體是結構和能量的結合體，衰老是隨著年齡的推移而發(fā)生的自然衰退現(xiàn)象。抵抗這種自然衰退需要能量修補或重建被損的功能。線粒體是一個敏感而多變的細胞呼吸器官。除細菌、藍綠藻和哺乳動物成熟的紅細胞以外,所有的真核細胞都有線粒體。線粒體具有三羧酸循環(huán)、電子傳遞和氧化磷酸化(oxidativephosphorylation,OXPHOS)的作用,線粒體電子傳遞鏈的氧化磷酸化反應為有機體生成約90%的能量(ATP),因而被稱為細胞的氧化中心和“動力工廠”。線粒體是除細胞核之外唯一含有DNA的細胞器,并擁有自己的遺傳密碼和蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)。因此,線粒體除了能量轉(zhuǎn)換作用,還與活性氧類(reactiveoxygenspecies,ROS)的生成、細胞氧化還原的信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡的調(diào)控和基因表達的調(diào)節(jié)等相關,涉及生物體的進化、發(fā)育、遺傳、代謝、衰老、心血管疾病、神經(jīng)-肌肉疾病、惡性腫瘤以及細胞死亡等多個重要問題。由于線粒體的生物學功能受細胞核和線粒體兩個遺傳體系的交叉控制,許多線粒體基因組和相關核基因組的變異,常與多種人體重要疾病的發(fā)生直接相關,線粒體疾病(mitochondrialdiseases)和線粒體醫(yī)學(mitochondrialmedicine)已經(jīng)發(fā)展成為生物醫(yī)學的新生長點。1人類的基礎教育1.1人線粒體基因組mthnda人線粒體基因組(humanmitochondrialgenome)包括1500多個基因,分屬于線粒體DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)和核基因組DNA(nuclearDNA,nDNA)兩個部分。除mtDNA自身編碼的37個基因外,其余與線粒體結構和功能相關的基因均由nDNA編碼。nDNA編碼線粒體的聚合酶、核糖體蛋白、結構蛋白和酶等蛋白質(zhì)分子。但一般以mtDNA作為人線粒體基因組的代名詞。1981年,劍橋大學的Anderson等測定了人mtDNA的全序列,故線粒體基因組序列又稱劍橋序列(CambridgeReferenceSequence,CRS)。人mtDNA為一條雙鏈環(huán)狀DNA分子,含16569bp,編碼2種rRNA(12SrRNA、16SrRNA)、22種tRNA和13種蛋白質(zhì)亞基的基因,共37個基因。1999年,Andrew等重新測序了Anderson等所用的原胎盤組織樣本的mtDNA,糾正了18個序列差錯,包括7個罕見的DNA多態(tài)性:263A、311C-315C、750A、1438A、4769A、8860A和15326A,11個測序錯誤:3107del、3423T、4985A、9559C、11335C、13702C、14199T、14272C、14365C、14368C和14766C。截止2006年1月18日,國際公認的人線粒體基因組序列為2001年的修正版(RevisedCRS,rCRS)。然而,人線粒體基因組實際全長為16568bp,原第3107位的堿基是不存在的。只是考慮到已經(jīng)約定俗成,故仍然把mtDNA的全長定為16569bp,將缺失的第3107位的堿基(3107del)表示為“X”。1.2mtcda的遺傳多樣性與人核DNA的31億堿基對、3~4萬個基因的龐大組成相比,人mtDNA的大小相差甚遠。但是,mtDNA的突變有其特殊的遺傳特征:①母系遺傳。一個卵母細胞大約擁有10~20萬個線粒體,每個線粒體至少含有幾個DNA分子。但每個精子只有幾百個線粒體,因而mtDNA的遺傳表現(xiàn)為母系遺傳(maternalinheritance),母親所攜帶的mtDNA突變可遺傳給所有的子女(男或女)。②異質(zhì)性(heteroplasmy)。當一個細胞內(nèi)mtDNA發(fā)生突變時,細胞內(nèi)同時存在野生型和突變型兩種類型的mtDNA。③閾值效應(threshold)。突變mtDNA分子的數(shù)量只有在達到某種程度時才足以引起人體器官或組織的功能異常。④廣譜性。mtDNA的任何突變都可能累及人體基因組中的重要功能區(qū)域部分,使得病理性mtDNA突變極為常見。⑤高突變率。mtDNA的突變率比nDNA高10倍以上。2導致細胞活力缺失目前的研究發(fā)現(xiàn),細胞的“電站”——線粒體需要一定的化學物質(zhì)來保證細胞的活力和清除細胞的毒素。如果這個“充電”過程減弱,細胞能量枯竭,則容易導致心肌梗塞、慢性疲勞和神經(jīng)退行性疾病等。例如,nDNA的突變可影響有關OXPHOS的結構基因和組裝基因、mtDNA維持基因以及線粒體融合和移動基因的功能,而編碼OXPHOS酶亞基基因的嚴重突變將導致一種常見的兒童致死疾病——Leigh綜合征。2.1mtcda的變異性線粒體在氧化過程中,產(chǎn)生大量的ROS(H2O2、O2-、HO2、OCl-和OH-等),ROS可激活線粒體透性轉(zhuǎn)變通道(mitochondrialpermeabilitytransitionpore,mtPTP),造成能量缺損和氧化性損傷,引起細胞凋亡。由于長期遭受ROS的攻擊,導致哺乳動物mtDNA具有極高的突變率。因此,mtDNA分子雖然較小,但mtDNA疾病卻很常見。1956年,Harman首先提出衰老的自由基假說,之后又認為在人類衰老過程中mtDNA是自由基攻擊的主要目標,線粒體可被看作一座“衰老鐘”(agingclock)。20世紀80年代初,Miquel等提出“細胞衰老學說”,認為衰老是由細胞分化及隨后氧自由基攻擊mtDNA造成的。1988年,Holt等首次證實線粒體疾病與線粒體突變之間存在關聯(lián)。1989年,Linnane提出mtDNA突變的累積是衰老的重要原因。以后數(shù)十余年間,學者們又發(fā)現(xiàn)許多與衰老相關的退行性疾病(衰老病),包括Alzheimer病、Parkinson綜合征、Huntington舞蹈癥、脊髓側索性硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)、心肌病(cardiomyopathies)、糖尿病和惡性腫瘤等,其主要病因是mtDNA的變異。1995年,Ozawa提出衰老的線粒體氧化還原機制,即mtDNA的氧化損傷引起mtDNA突變的累積,導致能量產(chǎn)出缺陷、衰老和細胞死亡。mtDNA突變是退行性疾病普遍存在的現(xiàn)象,主要包括點突變、缺失突變和DNA重排,其中DNA片段的缺失與衰老及疾病的關系較為密切。常見的點突變有:①位于tRNALeu基因第3243位點的A→G突變,引起線粒體腦肌病伴乳酸血癥和卒中樣發(fā)作(MELAS);②tRNALys基因第8344位點的A→G突變,常見于肌陣攣性癲癇伴碎紅肌纖維(MERRF);③ATPase6基因第8993位點的T→G突變,常見于神經(jīng)性肌無力、共濟失調(diào)及視網(wǎng)膜色素沉著;④ND4基因第11778位點的G→A突變,引起Leber視神經(jīng)萎縮(LHON);⑤tRNAIle基因第4269位點的A→G突變,導致心肌病;⑥tRNAGln基因第4336位點的G突變,可見于5%的晚發(fā)型Alzheimer病患者和7%的Alzheimer病與Parkinson病并發(fā)患者;⑦mtDNA調(diào)控區(qū)(CR)T414G突變,可見于63%的Alzheimer病患者。較常見的與衰老相關的缺失突變則是4977bp~5kb片段的缺失,在心、骨骼肌和腎等各臟器中均可找到該突變,稱之為“共有缺失”。在嬰幼兒中未檢測到此種缺失,但在年長者的多種組織中均存在。此外,在老年人中還發(fā)現(xiàn)了7.4kb、6.0kb和3.6kb的缺失片段,甚至在1個退行性腦肌病患者中發(fā)現(xiàn)從復合物II基因至細胞色素b基因之間的特長片段缺失。上述缺失大多在穩(wěn)定組織(如神經(jīng)、肌肉組織)中比例較高,而在血細胞等細胞快速分裂的組織中則較少見。在衰老相關性退行性疾病中,可觀察到mtDNA缺失突變的顯著增加。例如,與正常個體相比,5kb缺失片段在慢性冠心病患者中升高了7~2200倍;在<75歲的Alzheimer病患者中平均升高15倍,在>75歲的Alzheimer病患者中則占了1/5的比例。以往認為,在人、猴和嚙齒類動物的衰老過程中,mtDNA所發(fā)生的點突變和缺失會在各種組織中積累起來,在某些細胞中呈不均衡分布,并發(fā)生克隆性累積,從而導致諸如心、骨骼肌和腦等組織細胞呼吸鏈功能的缺陷。但這種缺損對衰老的影響一直沒有直接證據(jù),故長期存在爭論。2004年,Larsson實驗小組通過基因工程手段育成PolgA酶有缺陷的小鼠,使小鼠的mtDNA聚合酶的校對活性下降,使之具有較高的突變速率(點突變發(fā)生率提高了3~5倍),缺失的mtDNA數(shù)量也有所上升。結果發(fā)現(xiàn),這種散在性的mtDNA突變與小鼠的短壽密切相關,mtDNA突變小鼠出現(xiàn)與早衰相關的癥狀:體重減輕、皮下脂肪減少、脫毛、脊柱彎曲、骨質(zhì)疏松、貧血、生殖力下降和心臟肥大,并在12個月左右死亡(正常小鼠24~36個月死亡)。這表明,mtDNA突變與衰老表現(xiàn)型之間存在因果關系。2.2嘴唇氧化應激與nDNA相比,mtDNA更容易遭受氧化損傷和誘變源的攻擊,原因可能在于:①線粒體內(nèi)膜的脂類含量高,親脂性誘導突變的化合物易在mtDNA附近積聚;②mtDNA沒有組蛋白保護;③mtDNA缺乏完善的DNA切除修復機制;④mtDNA沒有內(nèi)含子,任何突變都能影響DNA的編碼序列。根據(jù)衰老過程的線粒體理論,mtDNA所發(fā)生的突變的積累,會導致生物體發(fā)生漸進性能量缺乏、細胞損傷和退化,mtPTP開放增加,以致凋亡因子(如細胞色素C,procaspase2、3、9和凋亡誘導因子AIF)由線粒體內(nèi)外膜間釋放,最終引起細胞凋亡。已發(fā)現(xiàn)線粒體氧化應激(oxidativestress)是細胞凋亡的早期事件。例如,無論秀麗線蟲還是酵母,都可通過過表達NAD+-依賴性蛋白脫乙酰酶Sir2基因來延壽。Sir2的部分功能是利用forkhead轉(zhuǎn)錄因子的脫乙?；图せ钭饔?幫助其在核內(nèi)重新定位和轉(zhuǎn)錄激活。研究發(fā)現(xiàn),線粒體OXPHOS缺陷將增加NADH/NAD+的比例,抑制SIR2,促進forkhead轉(zhuǎn)錄因子的乙酰化,關閉抗氧化和應激反應基因的表達,降低抗氧化防護功能,導致衰老。相關哺乳動物衰老的研究,與已報道的秀麗線蟲、果蠅等無脊椎動物的研究結果吻合。衰老是引起神經(jīng)退行性疾病(包括Alzheimer病、Parkinson綜合征和ALS等)的主要危險因素,許多研究顯示氧化應激參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。腦線粒體受到氧化應激的程度較肝線粒體為重,這與衰老時神經(jīng)元的損傷比肝細胞更為嚴重的觀察結果相吻合。但在2005年,Kujoth等培育出POLG校對活性缺陷致mtDNA突變累積的小鼠動物模型,發(fā)現(xiàn)實驗小鼠的mtDNA受損速度加快,進而出現(xiàn)掉毛、白毛、脊椎骨彎曲等現(xiàn)象,并罹患老年性耳聾。實驗小鼠只能活15個月。Kujoth等發(fā)現(xiàn)正常小鼠和實驗小鼠線粒體的氧化應激沒有量的區(qū)別,提出一向被認為是促進衰老的ROS與衰老無關。3細胞基因治療mtDNA疾病的治療既可在代謝水平上,也可在基因水平上。代謝治療是指增加線粒體產(chǎn)能輸出,減少ROS的生成,穩(wěn)定mtPTP的措施。例如,服用維生素E和C等抗氧化劑,可減慢Alzheimer病癡呆的發(fā)展,增強血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能,改善患者的記憶力和認知行為?；蛑委焺t包括體細胞基因治療(改善患者臨床癥狀)和生殖細胞基因治療(徹底消除致病基因)兩類。體細胞基因治療可通過3種途徑實現(xiàn):①直接校正nDNA編碼的突變線粒體基因;②將正常mtDNA基因?qū)爰毎藘?nèi),使之生成正常的多肽鏈,重新轉(zhuǎn)運至線粒體,恢復正常功能;③直接修正突變的mtDNA。例如,Seo等于19