蘋(píng)果中正己醇降解酶的提取與分離純化研究

蘋(píng)果中正己醇降解酶的提取與分離純化研究

正自醇是食品加工的一部分，尤其是酒精飲料生產(chǎn)中產(chǎn)生的雜醇醇高級(jí)醇，具有強(qiáng)烈的刺激性，對(duì)食品的味道有不利影響。過(guò)多地?cái)z入會(huì)使人的神經(jīng)系統(tǒng)充血,引起頭痛,具有一定的生理毒性,即人們常說(shuō)的白酒上頭的原因。另外,正己醇也是引起大豆豆腥味的主要成分之一。近年來(lái),隨著人們對(duì)正己醇危害性認(rèn)識(shí)程度的加深,以及檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和檢測(cè)靈敏度的提高,人們對(duì)正己醇的生理毒害的重視程度也越來(lái)越高。適當(dāng)降低產(chǎn)品中正己醇含量對(duì)提高食品質(zhì)量和安全性有重要意義。目前,正己醇的轉(zhuǎn)化主要是化學(xué)方法,如將正己醇轉(zhuǎn)化為正己醛或己酸己酯。但是,化學(xué)催化會(huì)引入新的不安全因素,不適用于食品加工。酶法轉(zhuǎn)化則因其具有催化效率高、安全、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)在食品加工方面有很好的推廣應(yīng)用前景。已有研究顯示,正己醇大量地存在于各種植物組織中,呈現(xiàn)青草氣息的水果味,是蘋(píng)果鮮果和蘋(píng)果汁中香氣成分的重要組分之一。植物體內(nèi)正己醇主要由氨基酸的分解代謝或脂肪酸的合成代謝而產(chǎn)生。蘋(píng)果中的正己醇主要來(lái)自于果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的脂肪氧化酶和醇脫氫酶對(duì)脂肪酸的β氧化作用。Kim和Grosch研究發(fā)現(xiàn),蘋(píng)果中的脂肪氧化酶(LOX)能形成氫過(guò)氧化物,對(duì)蘋(píng)果中正己醇和正己醛的生成有重要作用;正己醛則在蘋(píng)果醇脫氫酶(ADH)的作用下生成正己醇,因而成熟的蘋(píng)果中同時(shí)存在正己醛和正己醇。由此推測(cè),如果上述反應(yīng)為可逆反應(yīng),則在蘋(píng)果體內(nèi)必然存在將正己醇轉(zhuǎn)化為正己醛或其它物質(zhì)的酶系。為此,利用蘋(píng)果體內(nèi)的酶系降低正己醇含量的生物轉(zhuǎn)化是有可能的。我們的前期研究也證明了蘋(píng)果中的確存在能夠降低正己醇的酶系,并對(duì)其作用的最適pH和最適溫度有了初步了解。本文擬在前期研究的基礎(chǔ)上,旨在為蘋(píng)果中的正己醇降解酶尋求較好的制備方法,并進(jìn)行初步純化的探索,為其進(jìn)一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1限公司進(jìn)口裝配蘋(píng)果:市售成熟的紅富士蘋(píng)果,無(wú)傷痕、無(wú)病害、品質(zhì)良好,購(gòu)于陜西楊凌水果市場(chǎng)。主要試劑:正己醇,色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司進(jìn)口分裝;丙酮、檸檬酸、檸檬酸鈉、三氯乙酸(TCA)、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過(guò)硫酸銨(AP)均為國(guó)產(chǎn)分析純;考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸、牛血清白蛋白,為優(yōu)級(jí)純。1.2儀器及其制備HZS-H水浴振蕩器,哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;GC9800(FP)氣相色譜儀,上?？苿?chuàng)色譜儀器有限公司;丹佛T-203型電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;ST-303織勻漿器,廣東美斯特電器;F-101電動(dòng)攪拌器,鞏義市英峪予華儀器廠;GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī),海安亭科學(xué)儀器廠;UB721紫外分光光度計(jì),日本島津;DYCZ-22A型電泳槽,北京六一儀器廠。1.3蘋(píng)果果皮提取物制備將多個(gè)同一品種蘋(píng)果(4℃預(yù)冷2d)果皮部分(厚度0.4～0.5mm)混勻之后,及時(shí)稱取200g,按照以下幾種方法分別處理,所得粗酶液均定容至100mL,冷藏備用。緩沖體系:0.1mol/L的4℃預(yù)冷的pH值4.6的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖溶液。(1)緩沖溶液提取法:稱取上述蘋(píng)果果皮200g,溶解于100mL上述緩沖體系,用組織勻漿器打碎,勻漿液超聲波破碎20min(冰浴),破碎功率固定為20kHz、20W,再用4層干凈紗布過(guò)濾,取濾液在4℃下4000r/min離心30min,取上清液冷藏于4℃冰箱,備用。(2)丙酮粉提取法:在200g上述蘋(píng)果果皮中加入50mL冷凍丙酮(-30℃),在高速組織勻漿機(jī)中打漿,將果漿轉(zhuǎn)入燒杯中,加入100mL冷凍丙酮,用玻璃棒緩慢攪拌1min,用真空泵抽濾,濾渣再用100mL冷凍丙酮溶解,經(jīng)玻璃棒攪拌均勻后,再次抽濾。如此反復(fù),直至濾渣為無(wú)色為止,濾渣轉(zhuǎn)入真空干燥器至干,即得粗酶粉。將上述粗酶粉溶解于100mL上述緩沖體系中,在4℃下用電子恒速攪拌器緩慢攪拌30min,再用4層干凈紗布過(guò)濾,取濾液在4℃下4000r/min離心30min,取上清液冷藏于-40℃冰箱,備用。(3)TritonX-100提取法:同(1)但緩沖體系中含1%的TritonX-100。(4)TritonX-100+PVPP提取法:同(1)但緩沖體系中含1%的PVPP和TritonX-100。1.4正在進(jìn)行的醇分解能力的測(cè)定1.4.1反應(yīng)系統(tǒng)正己醇濃度為1.3g/L的10mL檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液(pH4.6,濃度0.1mol/L),酶液用量2mL。1.4.2正己醇?xì)埩袅康臏y(cè)定測(cè)定粗酶液的正己醇降解能力時(shí),直接在1.4.1反應(yīng)體系中加入2mL粗酶液進(jìn)行反應(yīng),對(duì)照均為:用2mL上述緩沖體系代替酶液的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件:37℃、100r/min水浴,反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后,及時(shí)取樣,立即冰浴后置于4℃下貯存,用于測(cè)定正己醇?xì)埩袅?。每種體系進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)。1.5酶的提取和初始化合對(duì)正己醇的酶促分解有影響1.5.1粗酶活性測(cè)定在1.4.1反應(yīng)體系中加1.3中(1)、(2)、(3)和(4)提取粗酶液各2mL,按1.4.2中實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定正己醇降解能力。1.5.2蛋白質(zhì)含量和正己醇降解能力的測(cè)定—純化方法對(duì)酶活力影響取2mL粗酶液,分別加入(NH4)2SO4使飽和度達(dá)到70%,4℃靜置過(guò)夜,10000r/min離心30min,沉淀溶于pH值4.6,0.1mol/L檸檬酸緩沖液,經(jīng)同樣緩沖液透析,按1.7.3和1.4.2的方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量和正己醇的降解能力。1.5.3聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳參考Laemmli的方法進(jìn)行。對(duì)采用4種方法提取的酶及其70%(NH4)2SO4鹽析、透析處理的樣品進(jìn)行電泳分析。聚丙烯酰胺凝膠組成為4%(w/v)丙烯酰胺(濃縮膠)和12%(w/v)丙烯酰胺(分離膠),進(jìn)樣量為20μL。電泳所用電流,濃縮膠20mA、分離膠15mA。剝膠后用120g/LTCA浸泡10min,固定蛋白質(zhì)樣品。染色過(guò)夜后進(jìn)行脫色處理,脫色完畢后用寶生物(Bio-rad)呈像系統(tǒng)分析。1.6酶的初步提取丙酮粉法1.6.1nh42so4的降解提取的酶液參考謝棟的方法,確定最適(NH4)2SO4飽和度。取9個(gè)離心管,各加粗酶液2mL,分別加入(NH4)2SO4使飽和度達(dá)到20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%和100%,4℃靜置過(guò)夜,10000r/min離心30min,沉淀溶于pH值5.4,0.1mol/L檸檬酸緩沖液,經(jīng)同樣緩沖液透析,用聚乙二醇6000濃縮,測(cè)定每管的蛋白質(zhì)含量和正己醇的降解能力。1.6.2固相沉淀后2so4-7%飽和度nh42so4-1邊攪拌邊緩慢在粗酶液中加固體(NH4)2SO4至30%飽和度,4℃靜置8h,10000r/min離心10min,棄沉淀,上清液中再加固體(NH4)2SO4至70%飽和度,4℃靜置8h后10000r/min離心10min,同1.6.1處理。1.7指標(biāo)檢測(cè)1.7.1內(nèi)標(biāo)和氣相檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后的待測(cè)樣,用氣相色譜儀(GC9800/FID)按照頂空進(jìn)樣法檢測(cè)正己醇?xì)埩袅?以體積分?jǐn)?shù)5%4-甲基-2-戊醇的丙酮溶液作內(nèi)標(biāo)。氣相檢測(cè)用色譜柱為彈性石英毛細(xì)管柱DB-WAX-10(?0.53m×30m),載氣N2,進(jìn)樣量300μL,采取程序升溫,即第1階段初始溫度55℃,初溫保持時(shí)間3min,升溫速率:15℃/min,終止溫度200℃,終溫保持時(shí)間3min;第2階段,初始溫度0℃,升溫速率0℃/min,終止溫度0℃。1.7.2正己醇降解率測(cè)定通過(guò)內(nèi)標(biāo)法獲得對(duì)照和樣品中正己醇的保留時(shí)間和峰面積,以與每個(gè)處理相應(yīng)的對(duì)照為基準(zhǔn),計(jì)算正己醇降解率。式中,A0為對(duì)照的正己醇峰面積;A1為加酶后正己醇峰面積。1.7.3測(cè)定蛋白質(zhì)含量參考文獻(xiàn)所述方法,采用考馬斯亮藍(lán)G-250法檢測(cè)粗酶液中蛋白質(zhì)含量。1.7.4單位蛋白質(zhì)的正離醇分解量1.7.5酶純度多樣性2結(jié)果與分析2.1丙酮法所得粗酶液的活性Prisky等研究發(fā)現(xiàn),在非離子洗滌劑TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)存在的情況下,蘋(píng)果中的Lox酶的活性減小,說(shuō)明蘋(píng)果中的Lox酶可能與細(xì)胞膜有關(guān),需采用丙酮等有機(jī)溶劑或加入表面活性劑處理的方法提取。而大多數(shù)蛋白質(zhì)均可溶于水、稀鹽等溶液中,因此考慮用不同的溶劑提取酶。圖1顯示了用4種不同溶劑進(jìn)行提取所得粗酶液及其純化后蛋白的正己醇降解能力。結(jié)果顯示,方法(3)和(4)的提取緩沖液中加入TritonX-100或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮),所得酶液的活性均有顯著提高。這是因?yàn)門(mén)ritonX-100和PVPP屬于非離子型表面活性劑,能夠破壞細(xì)胞膜的脂膜結(jié)構(gòu),從而利于膜上酶蛋白的釋放。而作為非離子型溶液,丙酮提取所得酶液的活性也比較高,而且在鹽析后,其活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于用緩沖液體系提取所得酶液,可能是丙酮為有機(jī)溶劑也利于膜上蛋白的釋放,提取過(guò)程中去除了抑制酶活的糖份(總糖去除率為81.98%)或鹽析和透析過(guò)程中去除了粗酶中抑制因子的原因。提取所得粗酶液中還含有其它雜質(zhì),特別是糖份。這些物質(zhì)的存在都會(huì)給后續(xù)的分離純化帶來(lái)困難。因此,粗提液中的雜質(zhì)含量越少越好。在此,重點(diǎn)考察了提取液的含糖量。由圖2可以看出,丙酮法所得酶液中糖含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于緩沖液提取體系。這是因?yàn)楸谔崛〉倪^(guò)程中還有除糖、脫色、脫脂等作用。不同提取方法所得酶液的特性對(duì)比見(jiàn)表1?？梢钥闯?丙酮法所得粗酶液的總正己醇降解活性較差,但其單位酶活很高,是含TritonX-100,PVPP緩沖液的1.10～1.87倍。且丙酮粉法所得酶量較少,僅為5.0g(200g蘋(píng)果提取)左右。這與李立祥等研究結(jié)果類似?？紤]到正己醇降解酶的應(yīng)用,所得酶制劑不僅要考慮酶活性,更要著眼酶制劑本身的活性、體積和應(yīng)用性。曲拉通法和曲拉通+PVPP法所得粗酶液的活性雖然略高,但酶液體積大,不易貯存,尚需進(jìn)行濃縮、提純才能達(dá)到應(yīng)用要求,不利于酶的應(yīng)用。相對(duì)而言,丙酮粉法雖對(duì)正己醇降解酶活性有所損失,但純化倍數(shù)最高,加上其酶粉本身活性尚可、體積小和便于貯存、可以直接應(yīng)用,因此在應(yīng)用上具有優(yōu)勢(shì)。提取方法(2)、(3)和(4)純化倍數(shù)分別為1.12、0.90、0.61,丙酮粉法提取的酶液在經(jīng)過(guò)鹽析和透析處理后的酶活性增加幅度最大(增加49.28%)。這與馬歇克的研究結(jié)果相同。即,在純化的初始階段,酶的總活性表現(xiàn)為有所增加。這是因?yàn)辂}析和透析過(guò)程中除去了存在于初始提取物中的抑制因子,或者由于樣品中的物質(zhì)種類繁多而使活性未能呈現(xiàn)出量的線性依賴性。丙酮粉法所得粗酶的蛋白含量低于含TritonX-100,PVPP緩沖體系,但經(jīng)過(guò)初步純化后,其正己醇降解酶活力最大,且純化后蛋白含量明顯高于純化前。這說(shuō)明,用含TritonX-100,PVPP緩沖液體系所得酶液中多出的蛋白主要是雜蛋白,而不是酶蛋白。綜合考慮,確定丙酮粉法用于蘋(píng)果中正己醇降解酶的提取。2.2酶液條帶的顏色和顏色要分離純化未知酶系,首先要確定目標(biāo)酶的分子量等基本特性。在此,主要考察了粗酶中總蛋白的特性,而且側(cè)重分析了丙酮法所得粗酶液中的蛋白分布。由粗酶的全蛋白電泳圖譜(圖2)可以看出,丙酮粉法有10個(gè)條帶,蛋白分子量分布范圍較寬,且條帶顏色較深,說(shuō)明蛋白含量較高;其它2種方法所得粗酶中只有3條帶,蛋白分子量范圍較窄,且條帶顏色較淺,說(shuō)明蛋白含量較少。由此推測(cè),正己醇降解酶可能與細(xì)胞粒上的脂類物質(zhì)結(jié)合較緊,需采用丙酮等有機(jī)溶劑的方法提取?？傮w來(lái)看,小分子蛋白顏色深,含量較高,而大分子蛋白顏色較淺,含量較少。經(jīng)過(guò)硫酸銨處理過(guò)的酶液條帶顏色上有所增加,尤其是加入TritonX-100的方法,經(jīng)過(guò)處理后條帶數(shù)量和顏色均有所增加。據(jù)陳惠等研究可知,硫酸銨對(duì)酶有顯著的保護(hù)作用,鹽的添加能顯著改善酶的熱穩(wěn)定性。因?yàn)辂}類有離子鍵作用,當(dāng)酶的活性中心含有離子作為配位體時(shí),鹽離子就能穩(wěn)定酶的構(gòu)象。另外,鹽作為水分子的替代物占據(jù)水的位置,排除自由水對(duì)酶造成的不穩(wěn)定化影響。但曲拉通+PVPP法處理后卻減少了,具體的原因還需進(jìn)一步研究。2.3酶的初步提取2.3.1硫酸銨飽和度對(duì)蛋白質(zhì)分離的影響一般粗抽提物經(jīng)常利用鹽析法進(jìn)行粗分。硫酸銨沉淀常用作實(shí)驗(yàn)室蛋白純化的第一步,它可以初步粗提蛋白質(zhì),去除非蛋白成分。蛋白質(zhì)在硫酸銨沉淀中較穩(wěn)定,可以短期在這種狀態(tài)下保存中間產(chǎn)物,當(dāng)前蛋白質(zhì)純化多采用這種方法進(jìn)行粗分離。由圖3可見(jiàn),隨著硫酸銨飽和度的增加,所得蛋白的沉淀量和沉淀物的酶活均呈先上升后下降的趨勢(shì),并分別在硫酸銨飽和度60%和70%時(shí)達(dá)到最大值。硫酸銨飽和度小于30%時(shí),蛋白沉淀量和沉淀物的酶活都很低。硫酸銨飽和度為60%時(shí)所得蛋白質(zhì)的沉淀量雖然最大,但其酶活并未達(dá)最大值,說(shuō)明此時(shí)沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)主要是雜蛋白。綜合考慮,選用硫酸銨飽和度為30%～70%。2.3.2丙酮粉法提取酶nh42so4鹽沉淀分析對(duì)粗酶提取液進(jìn)行分級(jí)沉淀,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分級(jí)沉淀所得蛋白的正己醇降解率為88.56%±0.985%,說(shuō)明條件選擇合適。3討論和結(jié)論3.1蘋(píng)果期內(nèi)正己醇降解酶的作用效果及展望(1)通過(guò)酶法轉(zhuǎn)化降解正己醇含量具有專一性強(qiáng)、無(wú)毒副作用、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),在提高食品