關于濫用表中有效應對的藥物提取的研究

關于濫用表中有效應對的藥物提取的研究

世界博覽會規(guī)定，使用酒精違反體育和科學道德。按照國際奧委會醫(yī)學委員會的定義,使用興奮劑包括:使用屬于禁用藥物類的有關物質及使用各種不同的禁用方法。利尿劑屬于興奮劑中的一種,自從1989年冬奧運會宣布禁用利尿劑以來,利尿劑一直是監(jiān)控的重點。這不僅由于利尿劑在涉及重量級別項目(如舉重、拳擊等)中可用于減輕運動員體重,而且還常被作為一種稀釋尿液掩蓋其他禁用藥物的手段。因此除比賽期間外,在賽外抽查時也必須檢查利尿劑。由于社會上總有一些違背體育道德的人不斷發(fā)掘藥物用于體育比賽中,因此在國際奧委會公布的禁用表中,每年都會有一些新的藥物出現。近年來,禁用表中也有不少新的利尿劑出現,如吲滿速尿、克羅帕米、利多速尿和托拉沙米等。另外,按照國際奧委會對興奮劑的定義,未列入表內的相關化合物也同屬于禁用范疇。為及時跟上國際步伐,盡早建立和完善利尿劑的檢測方法,我們對新增藥物及系列利尿劑的相關化合物進行了研究。有關這些藥物的高效液相色譜(HPLC)檢測方法及氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)方法有部分報道,但缺乏系統(tǒng)分析的資料。作者首次用HPLC方法同時檢測了人尿中13種利尿劑,建立了HPLC的篩選方法。1實驗部分1.1de,tor吲滿速尿(indapamide,IND)的對照品來自Sigma;克羅帕米(clopamide,CLOP)、利多速尿(xipamide,XIP)、托拉沙米(torasemide,TOR)由韓國興奮劑實驗室提供;吡咯它尼(piretanide,PIR)、聚噻嗪(polythiazide,POLY)、氟甲噻嗪(flumethiazide,FLU)、三氯噻嗪(trichlomethiazide,TRI)、甲氯噻嗪(methylclothiazide,METH)、氫氟噻嗪(hydroflumethiazide,HF)、環(huán)噻嗪(cyclothiazide,CYC)、依托唑啉(etozoline,ETO)和喹噻酮(quiethazone,QUI)由加拿大INRS-Sante實驗室提供。1.2流動相、淋洗梯度HP1090高效液相色譜儀(美國),LichrosorbC18200mm×4.6mm,5μm液相色譜柱;流動相:pH3磷酸緩沖液(A)和乙腈(B);淋洗梯度:0.01minB15%(φ),10minB45%(φ),20minB65%(φ);DAD檢測器,檢測波長:216nm,230nm,275nm。1.3樣品處理1.3.1有機相的制備取尿樣3mL,加入酸性固體緩沖劑(磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉,質量比99∶1,pH5.0)0.5g,搖勻后加入4mL乙酸乙酯,振蕩萃取15min,離心分離出有機相,加入2mL50g/L醋酸鉛溶液,振蕩離心,吹干有機相,加入300μL甲醇溶解殘渣進樣。1.3.2u3000酸鉀溶液的萃取取尿樣3mL,加入堿性固體緩沖劑(碳酸氫鈉-碳酸鉀,質量比3∶2,pH9.0)0.5g,搖勻后加入4mL乙酸乙酯,振蕩萃取15min,離心分離出有機相,吹干,加入300μL甲醇溶解殘渣進樣。1.3.3固相萃取取尿液3mL過預先處理好的Sep＿Pak柱,水洗后,用甲醇洗脫,吹干,加入300μL甲醇溶解殘渣進樣。1.4標準溶液的制備于10mL具塞試管中加入2mL空白尿液,分別加入1μg上述藥物的混合標準溶液,按上述提取方法分別對藥物進行萃取。萃取物分別于50℃干熱反應器上氮氣流吹干,各加入300μL甲醇,進樣10μL進行色譜分離,然后與相同量對照品對照,測定峰面積,依次計算出各種化合物萃取的回收率。2結果與討論2.11可疑化合物的初步篩選按上述HPLC條件,除吲滿速尿與托拉沙米有部分重疊外,其他11種利尿劑均得到了很好的分離。如圖1和圖2所示,根據色譜中的保留時間及其特征的紫外光譜,可初步篩選出可疑化合物的存在。雖然吲滿速尿與托拉沙米的保留時間比較接近,但是兩者的紫外光譜有明顯的差異,最大吸收值差別很大,很容易區(qū)分。2.2萃取回收率和萃取選擇性測定興奮劑時對尿樣的處理大多采用液相萃取。根據其性質采取酸性、堿性或中性萃取。我們分別用酸性萃取、堿性萃取和固相萃取(SPE)3種方法提取了上述藥物,結果見表1。堿性萃取回收率除吡咯它尼為23%以外,其他12種化合物均比較高(>80%);固相萃取率除依托唑啉偏低為16%,三氯噻嗪為59.2%外,其它基本在75%以上。但是固相萃取選擇性較差,雜質峰比較多。分別取不同量上述對照品溶液加入空白尿中,按上述方法堿性萃取后進樣分析,觀察各進樣量下獲得的色譜圖,找出其最小進樣量,以3倍信噪比測定檢出限(DL),按絕對進樣量計算,該13種利尿劑的檢出限列于表1內,基本小于5ng,完全可以滿足國際奧委會的要求。2.3利尿劑的應用陽性尿由健康志愿者服藥后提供分別對吲滿速尿、克羅帕米、利多速尿、托拉沙米、吡咯它尼和聚噻嗪6種藥物4～20h的陽性尿進行了檢測,均獲得滿意的結果。圖3為服用1mg的利多速尿后6h收取的尿樣的HPLC色譜及紫外光譜圖。由于利尿劑在服藥后,主要以原型的形式從尿樣中排出,對于無法獲得陽性尿的藥物,我們將一定量對照品加入尿中進行了檢測,結果同樣令人滿意。在常規(guī)檢測中,對于可疑樣品,可以通過與陽性尿圖譜的保留時間及其特征的紫外圖譜對照,進行初步定性。如果需要,再通過質譜進一步確證。2.4原型化合物的檢測分別對吲滿速尿、克羅帕米、利多速尿、托拉沙米、吡咯它尼和聚噻嗪6種藥物的排泄曲線進行了研究,見圖4。幾