培養(yǎng)細胞之死活細胞的鑒別實驗報告

1/5生物化學實驗報告姓名于佳喜姓名于佳喜學號201300140120學院生命科學學院年級2013級生物基地班一、實驗目的1.1學習并掌握動物細胞培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。

1.2了解并掌握用組織塊貼壁培養(yǎng)法和消化細胞培養(yǎng)法進行動物細胞原代培養(yǎng)的實驗方法。

1.3熟練掌握動物細胞傳代培養(yǎng)的實驗方法。1.4學習細胞生死狀態(tài)鑒別的方法。1.5了解細胞生死狀態(tài)鑒別的原理。

1.6熟悉和掌握各種鑒別細胞生死狀態(tài)方法的判定特征。

1.7掌握細胞技術(shù)方法，計算細胞存活率二、實驗原理細胞培養(yǎng)指的是在無菌條件下，把動、植物細胞從組織中取出，在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使離體的細胞在體外生長和繁殖，并且維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)

細胞生死狀態(tài)的鑒別方法主要是化學染色法和熒光染色法。

活細胞和死亡細胞在生理技能和性質(zhì)上主要存在一下差異：①

細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性地通過；而細胞死后，細胞膜受損，其通透性增加?；诖?，發(fā)展出了以臺盼藍、伊紅、苯胺黑、赤蘚紅、甲基藍以及熒光染料碘化丙啶或溴化乙啶等為染料鑒別細胞生死狀態(tài)的方法，上述染料能使死亡細胞著色，而活細胞不被著色。此外，應用植物質(zhì)壁分離的性質(zhì)也可鑒定植物細胞的生死狀態(tài)?；罴毎脑|(zhì)具有選擇透過性，死細胞因其原生質(zhì)的選擇透過性已遭破壞，故與高滲透壓溶液接觸時不產(chǎn)生質(zhì)壁分離。②

代謝上的差異：活細胞中新陳代謝作用強，細胞內(nèi)的酶具有較強的活性和還原能力?；诖?，發(fā)展處了以熒光素二乙酸酯（FDA）、熒光素二丙酸酯、熒光素二丁酸酯或熒光素二苯甲酰酯等酯化的熒光素鑒別細胞生死狀態(tài)的方法，上述酯化的熒光素親脂性提高，容易被細胞吸收進入，活細胞內(nèi)的酯酶具有較強的活性，可將酯化的熒光素分解而釋放出能發(fā)熒光的熒光素，該物質(zhì)不能自由透過活的細胞膜，積累在細胞內(nèi)，熒光顯微鏡下顯示有明亮的綠色或黃綠色熒光；而死亡細胞內(nèi)的酯酶因失去活性，不能分解酯化的熒光素，熒光顯微鏡下顯示不發(fā)光。另外，可用亞甲基藍為染料鑒定酵母細胞的生死狀態(tài)。亞甲基藍是一無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色。活細胞因具有較強的還原能力，能使亞甲藍從藍色的氧化型變成無色的還原型，故活的酵母細胞在用亞甲基藍染色后顯示無色；死亡酵母細胞或代謝緩慢的衰老酵母細胞，因無還原能力或還原能力極弱，使亞甲藍仍處于氧化態(tài)，故呈現(xiàn)藍色或淡藍色。三、實驗器材3.1

器材：解剖剪、解剖鑷、培養(yǎng)皿、紗布塊、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、L型注射器、離心管等。上述器材需徹底洗凈、烤干、包裝好，滅菌，備用。

超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、普通光學顯微鏡、離心機、血球計數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、試管架、記號筆、解剖板、蓋玻片等。

3.2試劑：培養(yǎng)液、PBS液

0.4%臺盼藍染液3.3材料：小白鼠四、操作步驟4.

1取材

取小白鼠一只，采用斷頭法處死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中滅菌3分鐘。取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)的解剖盤內(nèi)，無菌操作打開腹腔。取出脾臟，去除其周圍的脂肪組織，鑷起脾臟用PBS液自上而下沖洗1—2次。轉(zhuǎn)入無菌玻璃培養(yǎng)皿，待用。

4.2

分離脾細胞

4.2.1用滴管先向上述無菌玻璃培養(yǎng)皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型針頭注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后將其沿脾長軸方向注射入脾內(nèi)（使脾臟膨脹以利于細胞散開）。

4.2.2用針尖在脾臟上扎眼，并用“L”針頭輕刮脾臟表面擠出脾細胞，用滴管吸皿中的PBS液沖脾臟并吹散刮出的脾細胞，稍傾斜并靜置1—2分鐘。

4.2.3吸取上述靜置后的脾細胞懸液上清部分放入Eppendorf發(fā)管，并使量至1ml，以3000r/分離1—2分鐘。

4.3

培養(yǎng)脾細胞

4.3.1超凈工作臺中取塑料培養(yǎng)皿一個，用移液槍（1000μl）加入細胞培養(yǎng)液2ml，并在皿蓋上畫上標記，待用。4.3.2

取上述離心后的Eppendorf管，在超凈工作臺內(nèi)開蓋棄去上清液，用移液槍（200μl）吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ml加入棄去上清液的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細胞，然后吸取200ml脾細胞懸液接種于上述塑料培養(yǎng)皿中，混勻，然后放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.4

臺盼藍法鑒定細胞的生死狀態(tài)：

4.4.1試劑配制：用生理鹽水配置0.4%臺盼藍染液，備用。4.4.2染色計數(shù)：取0.5ml細胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少許染色后的細胞懸液于放有蓋片的血球計數(shù)板的斜面上，使懸液自然充滿計數(shù)板小室。注意不要使小室內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，否則要重新滴加。在普通光鏡10倍物鏡下計數(shù)四個大格內(nèi)的細胞數(shù)，壓線者數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。

4.4.3根據(jù)染色結(jié)果計算活細胞率：依據(jù)死細胞染成藍色、活細胞不著色的原則計數(shù)死細胞數(shù)和細胞總數(shù)，以如下公式計算細胞存活率：

細胞存活率=（細胞總數(shù)-死亡細胞數(shù)）/細胞總數(shù)

*100%4.5關于血球計數(shù)板

4.5.1血球計數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有四條槽而構(gòu)成三個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分割成兩半，每個半邊上面各有有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分九大格，其中間的一大格（又稱計數(shù)室）常被用作細胞的計數(shù)。

計數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個中方格,而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)室是哪一種構(gòu)造，他們都有一個共同特點，即每個大方格都有400個小方格組成。

圖1血球計數(shù)板的構(gòu)造(a、平面圖；b、側(cè)面圖)圖2血球計數(shù)板網(wǎng)格的分區(qū)和分格每個大方格邊長為1mm,則每一大方格的面積為1mm2,每個小方格的面積為1/400mm2,蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)室底部之間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)室（大方格）的體積為0.1mm3，所以每個小方格的體積為1/400mm3若取四個大方格的細胞數(shù)，則：

每毫升液體中細胞的數(shù)=每個大方格中的細胞數(shù)量*10000*稀釋倍數(shù)4.5.2此次實驗中，使用的是前一種血球計數(shù)板，因此分別選取左上、左下、右上、右下四個中方格進行計數(shù)。五、注意事項5.1在進行方格查數(shù)時注意：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)下不數(shù)上。

5.2

實驗涉及的臺盼藍染料有致癌危險，因此滴加染液時要小心，防止濺到皮膚上。

5.3動物細胞培養(yǎng)使用的所有器皿、用具、溶液等必須經(jīng)過嚴格消毒或除菌處理，才能進超凈工作臺中使用，整個實驗過程都要有無菌操作的概念，避免細胞被污染。

5.4在超凈工作臺內(nèi)點燃酒精燈后，實驗操作應在火焰的附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼后要待其冷卻才能夾取組織，經(jīng)過培養(yǎng)液的用具不能長時間燒灼，以免燒焦形成碳膜。

5.5超凈工作臺內(nèi)吸取溶液用的的各種吸管等不能混用，以免相互污染。

5.6在超凈工作臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能敞開暴露過久，以免溶液蒸發(fā)和pH變化。

5.7

器皿、離心管培養(yǎng)瓶等在離開超凈工作臺前必須將蓋子或橡皮塞蓋緊，以防止細胞污染或溶液漏出。六、實驗結(jié)果取樣位置左上左下右上右下活細胞數(shù)27333537死細胞數(shù)78618980細胞總數(shù)10594124117每大格細胞總數(shù)平均值為110，每大格平均死亡細胞數(shù)為77每毫升溶液中細胞總數(shù)=110*10000*2=2.2*106個細胞存活率=（110-77）/110*100%=30.0%七、分析與討論7.1實驗數(shù)據(jù)討論此次實驗，我組測得細胞存活率為30.0%，經(jīng)過交流，有些組的細胞存活率達到44.6%，分析存活率相對較低的原因如下：7.1.1無菌操作的過程中操作不規(guī)范，導致染菌，會影響觀察，導致實驗失??；

7.1.2在離心分離呈單細胞的過程中離心機轉(zhuǎn)速過快或時間過長很可能會導致細胞破裂，導致小鼠脾細胞大量死亡；

7.1.3染色時間過長，或觀察時間過長都會導致染色試劑將細胞殺死，使細胞活力驟降，這是導致細胞活力比較低的重要原因；

7.1.4實驗中的一些操作不正確或不規(guī)范的情況、計算帶來的誤差等也會直接導致實驗誤差。

7.1.5取液時沒有搖勻細胞液，導致取液不均勻。7.1.6培養(yǎng)時間過長，養(yǎng)分耗盡。7.2關于支原體污染此次實驗中，有同學培養(yǎng)的細胞被真菌污染，細胞被細菌或真菌污染時很容易檢測和預防，而因為它極小，直徑在0.2-2

μm，可以輕松地通過濾膜，混入培養(yǎng)系統(tǒng)中；而且它沒有剛性的細胞壁，因此普通的抗生素對它根本不起作用?；谝陨蟽牲c，它即使生長到很高密度，也沒有明顯的污染跡象。細胞培養(yǎng)，特別是傳代細胞，被支原體污染是個世界性問題。有研究報告稱25%的細胞都存在支原體污染。由于體外培養(yǎng)細胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養(yǎng)細胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。支原體污染后，因為它們不會使細胞死亡可以與細胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則細胞手到多方面潛在影響，如引起細胞變形，影響DNA合成，抑制細胞生長等。

支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（某些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、被污染細胞造成的交叉污染、實驗器材的污染、制備細胞的原始組織或器官的污染，等等。此次細胞培養(yǎng)實驗幾乎全部都是在無菌條件下進行，培養(yǎng)基和器材都保證無菌，并對實驗操作進行了嚴格規(guī)范，基本能夠保證避免支原體污染。課后作業(yè)1.抑制腫瘤細胞增殖藥物的篩選方法1.1MTT分析法以活細胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT噻唑藍為基礎。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍色的formazan結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量僅與活細胞數(shù)目成正比(死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原)。還原生成的formazan結(jié)晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉(pH4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶標儀測定490nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數(shù)目。也可以用DMSO來溶解。步驟：a)接種細胞用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1000－10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。b)培養(yǎng)細胞同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3－5天(可根據(jù)試驗目的和要求決定培養(yǎng)時間)。c)呈色培養(yǎng)3－5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20ul.繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。d)比色選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。1.2NCI所用的體外化療藥物篩選法簡單地說，NCI的體外化療藥物篩選系統(tǒng)由60種不同的人體腫瘤細胞株組成，測定每個受試化合物在一定濃度范圍抑止各腫瘤細胞的生長的能力或細胞毒性程度。以常規(guī)采用的篩選試驗為例，在實驗開始前一天，所有60種腫瘤細胞株細胞先接種在96孔細胞培養(yǎng)板上，然后將受試化合物10倍梯度稀釋，一般最高濃度采用10－4mol。每種化合物試驗5種不同濃度。樣品加入細胞懸液后培育48小時。此后用細胞染色法測定細胞的生長曲線，用sulforhodamine染色，再測定吸光度用以估計細胞數(shù)目。根據(jù)比色結(jié)果畫出60條劑量一反應曲線，然后計算出50％生長抑止?jié)舛?GI50)，100％生長抑止?jié)舛?TGI)以及50％細胞死亡濃度(LC50)。再將各細胞系的GI50、TGI和LC50匯總畫出均數(shù)圖，從此圖可以大致看出該化合物對不同的腫瘤細胞株的抑制能力。然后用計算機進行計算、模擬、比較，評價受試化合物的特征是否與某一類已知化療藥物類似，從而推測可能存在的抗癌機制。據(jù)統(tǒng)計，NCI到目前為止已篩選了近460000種化合物。用NCI體外化療藥物篩選系統(tǒng)得出的數(shù)據(jù)也可用于指導將來對主要化合物的改造，使化合物的藥理及毒理性質(zhì)更為理想。1.3以分子生物學為基礎的化療藥物篩選方法近年來，對腫瘤的分子生物學研究取得了很大的進展，這給化療藥物的發(fā)展提供了一些新的目標?，F(xiàn)在已有許多采用X射線衍射、蛋白結(jié)晶、基因配對等方法來推斷及設計抗癌藥物。這些方法往往開拓了一些全新的途徑，但其缺點是這些化合物不一定對腫瘤細胞有選擇性。另外，這些化合物是否能進入腫瘤細胞也是一大問題。因此，任何采用非細胞系統(tǒng)篩選的化合物都必須經(jīng)過細胞系統(tǒng)以及合適的動物模型的檢定才能進入臨床試驗。1.4經(jīng)典的化療藥物篩選模型1985年NCI建立體外細胞篩選系統(tǒng)。在此之前，NCI抗癌藥物的篩選方法主要采用體內(nèi)腫瘤模型來進行。將白血病細胞株L1210及P388植入免疫缺陷鼠體內(nèi)，待腫瘤長成后再給予不同劑量的篩選化合物，然后觀察所試化合物是否能抑制腫瘤細胞的生長，甚至使腫瘤細胞死亡、消失。然后再作計算分析，得出最小抑制劑量、中位抑制劑量、LC50等指標；以這些指標作為衡量受試化合物的抗癌作用強度。這一方法的優(yōu)點是得到的藥物可穿過細胞膜以及某些生理屏障，缺點是所得到的藥物僅對快速分裂的腫瘤(如白血病、淋巴瘤)療效較好，而對實體瘤的治療遠不盡人意。針對這一問題，NCI在1985年對抗癌藥物的篩選過程作了如下重大改變：①利用以腫瘤種類為指導的體外細胞篩選法取代體內(nèi)篩選法；②利用實體瘤細胞株取代白血病細胞株；③用相對小量的原始材料用于初篩；④重新強調(diào)利用生物實驗指導天然物中具抗癌活性成分的篩選。體內(nèi)實驗的免疫缺陷鼠腫瘤模型現(xiàn)已不常用于藥物的初篩，而常規(guī)用于對初篩所得的先導藥物作進一步測試以觀察評估