第八章抗生素分析課件

第八章抗生素類藥物的分析第八章抗生素類藥物的分析1第一節(jié)概述第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法第三節(jié)抗生素藥物的分析第一節(jié)概述2世界各國(guó)實(shí)際應(yīng)用的抗生素有300多種，我國(guó)藥典中收載的品種有200多種。生物發(fā)酵，化學(xué)純化，精致，化學(xué)修飾等過(guò)程，最后制成制劑，結(jié)構(gòu)，組成更復(fù)雜?；瘜W(xué)純度低，有三多：同系物多，異構(gòu)體多，降解物多。發(fā)酵過(guò)程不易控制。生產(chǎn)工藝復(fù)雜易受污染。分子結(jié)構(gòu)大多不穩(wěn)定，降解后療效下降、失效或增加毒副作用?；钚援a(chǎn)物易發(fā)生變異。一、抗生素藥物的特點(diǎn)第一節(jié)概述世界各國(guó)實(shí)際應(yīng)用的抗生素有300多種，我國(guó)藥典中收載的品種有3二、抗生素類藥物的檢查項(xiàng)目抗生素的檢查項(xiàng)目是由抗生素的生產(chǎn)、用途、毒副作用等決定的。一般來(lái)說(shuō)，各種抗生素及其制劑的性質(zhì)及工藝不同，檢查項(xiàng)目也不同。注射劑型檢查項(xiàng)目多、要求嚴(yán)；口服劑型、外用藥檢查項(xiàng)目少、要求松。

第一節(jié)概述二、抗生素類藥物的檢查項(xiàng)目抗生素的檢查項(xiàng)目是由抗生素的生產(chǎn)、4鑒別試驗(yàn)：用物理化學(xué)方法判定抗生素真?zhèn)蜗嚓P(guān)物質(zhì)的檢查：抗生素產(chǎn)生過(guò)程中產(chǎn)生的中間體、副產(chǎn)物、貯存過(guò)程中的降解產(chǎn)物(TC\ETC\EATC)酸堿度檢查：保證產(chǎn)品的穩(wěn)定性和適用于臨床應(yīng)用水分的檢查：限制水分，以免水解反應(yīng)溶液澄清度檢查：限制不溶性雜質(zhì)檢查項(xiàng)目：第一節(jié)概述鑒別試驗(yàn)：用物理化學(xué)方法判定抗生素真?zhèn)螜z查項(xiàng)目：第一節(jié)概5無(wú)菌檢查：檢查有無(wú)雜菌異常毒性試驗(yàn)：限制產(chǎn)品中的致毒物質(zhì)熱源試驗(yàn)：限制產(chǎn)品中的致熱物質(zhì)降壓物質(zhì)檢查：限制產(chǎn)品中降低血壓的物質(zhì)效價(jià)檢查：檢查抗生素含量與活性其它檢查：檢查抗生素各組分之間的比例（GMC），比旋度檢查(TC\ETC)、熔點(diǎn)檢查(羥氨芐青霉素)、晶型檢查（金霉素、利福平）、溶劑殘留量（甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、二氯甲烷等等）第一節(jié)概述無(wú)菌檢查：檢查有無(wú)雜菌第一節(jié)概述6其中無(wú)菌試驗(yàn)的目的是檢查藥物是否染菌。有抑菌作用的藥物的微生物限度檢查，應(yīng)該先將抗生素活性滅活，或者除去抗生素，這樣才能使制品中所污染的雜菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)出來(lái)，才能判定是否染菌。去除抗生素影響的辦法很多，但是又要保證雜菌不被殺死，一般有以下方法：第一節(jié)概述其中無(wú)菌試驗(yàn)的目的是檢查藥物是否染菌。有抑菌作用的藥物的微生7青霉素酶法：青霉素酶先與青霉素類藥物作用一段時(shí)間，使其水解b-內(nèi)酰胺環(huán)部分而滅活，對(duì)細(xì)菌無(wú)抑殺作用。這種方法只對(duì)青霉素有效，特異性高。鹽酸羥胺法：鏈霉素與鹽酸羥胺反應(yīng)生成鏈霉污，可使鏈霉素失活。只對(duì)鏈霉素有效，特異性高。樹脂法：以無(wú)菌的鈉型樹脂與堿性抗生素的水溶液混合，放置，抗生素被交換吸附到樹脂上，而被去除，雜菌則留在中性或者偏堿性的水溶液中，這樣取流出液作無(wú)菌檢查。無(wú)菌濾膜過(guò)濾法：將抗生素水溶液通過(guò)無(wú)菌濾膜，抗生素被除去而雜菌被截留在濾膜上。取此濾膜作無(wú)菌檢查。這種方法應(yīng)用最廣，但是操作過(guò)程中不得引入其他雜菌，以免錯(cuò)誤判斷。第一節(jié)概述青霉素酶法：青霉素酶先與青霉素類藥物作用一段時(shí)間，使其水解b8三、抗生素效價(jià)的標(biāo)示量1.效價(jià)定義：早期抗生素產(chǎn)品往往不是純品，因此無(wú)法用重量單位表示其活性。因此，為了與臨床上應(yīng)用原理保持一致，以抗生素的抑制或者殺死細(xì)菌的能力作為衡量抗生素活性的指標(biāo)，這個(gè)指標(biāo)就叫做效價(jià)，即以效價(jià)的高低作為抗生素質(zhì)量的標(biāo)示。通常，新發(fā)現(xiàn)的抗生素在初期尚未得到純品時(shí)候，常常用上述方法來(lái)確定效價(jià)，或者用性質(zhì)相近的已知抗生素作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量其效價(jià)。第一節(jié)概述三、抗生素效價(jià)的標(biāo)示量1.效價(jià)定義：通常，新發(fā)現(xiàn)的抗生素在9最早確定效價(jià)的抗生素是青霉素，其效價(jià)單位定義是：在實(shí)驗(yàn)條件下，能完全抑制50ml肉湯培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株生長(zhǎng)的青霉素的最低含量為一個(gè)效價(jià)單位，即一個(gè)牛津單位，也叫做一個(gè)生物活性單位。鏈霉素的效價(jià)單位：能完全抑制1ml肉湯培養(yǎng)基中大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株生長(zhǎng)的鏈霉素的最低含量為一個(gè)效價(jià)單位。第一節(jié)概述最早確定效價(jià)的抗生素是青霉素，其效價(jià)單位定義是：在實(shí)驗(yàn)條件下10隨著抗生素分離純化技術(shù)的不斷提高，現(xiàn)在已經(jīng)能制備純凈的抗生素，可以用重量來(lái)表示其效價(jià)。首先制備出純凈的抗生素為芐青霉素鈉（PcGNa）,1949年國(guó)際聯(lián)盟衛(wèi)生組織通過(guò)試驗(yàn)證明，1mgPcGNa能夠抑制83300ml肉湯培養(yǎng)基中的標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌的株生長(zhǎng)，即相當(dāng)于1mgPcGNa=1667u（83300/50），1uPcGNa=0.6ug。第一節(jié)概述隨著抗生素分離純化技術(shù)的不斷提高，現(xiàn)在已經(jīng)能制備純凈的抗生素112.抗生素的效價(jià)標(biāo)示方法：

重量單位：以抗生素中所含特定的抗菌活性部分（純游離堿或游離酸）的重量1微克作為1單位，即1毫克=1000單位。如鏈霉素硫酸鹽、土霉素鹽酸鹽等均以重量單位表示。用這種方法表示，對(duì)不同有機(jī)酸根的同一抗生素，只要單位一樣或有效部分重量一樣，則這一抗生素的各種鹽類雖然稱重不同，但實(shí)際有效含量是相同的。這樣標(biāo)示的抗生素有：紅霉素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素、氯霉素、新生霉素、利福霉素SV。第一節(jié)概述2.抗生素的效價(jià)標(biāo)示方法：重量單位：以抗生素中所含特定的12類似重量單位：以特定的純抗生素制品鹽的重量，規(guī)定1毫克＝1000單位，其中包括了無(wú)抗菌活性的酸根在內(nèi)，如四環(huán)素鹽酸鹽（包括無(wú)生物活性的鹽酸根在內(nèi)）。這種"類似重量單位"，雖然并不合理，但在國(guó)際上已經(jīng)習(xí)慣沿用。第一節(jié)概述類似重量單位：以特定的純抗生素制品鹽的重量，規(guī)定1毫克＝1013重量折算單位：以特定的純抗生素制品的某一重量為效價(jià)單位而加以折算。如第二次青霉素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（1952年）青霉素G鈉稱重0.5998微克為1單位，即1毫克=1670單位，那么80萬(wàn)單位的青霉素G鈉稱重應(yīng)為0.48克。雖然青霉素G制品現(xiàn)已完全可用化學(xué)或物理方法檢驗(yàn)其含量，但仍廣泛使用效價(jià)單位的表示方法。第一節(jié)概述重量折算單位：以特定的純抗生素制品的某一重量為效價(jià)單位而加以14特定單位：以一特定量的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品（或?qū)φ掌罚┳鳛?單位。如第一批桿菌肽國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（1953年）桿菌肽A為1毫克=55單位。制霉菌素（1963年）為1毫克=3000單位等。這類抗生素的效價(jià)單位的精確定義很難確定，折算效價(jià)也難以計(jì)算，只能以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)單位，作為比較的基準(zhǔn)。第一節(jié)概述特定單位：以一特定量的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品（或?qū)φ掌罚┳鳛?單位。第15半合成新霉素、頭孢菌素類藥物純度較高，化學(xué)結(jié)構(gòu)確定，規(guī)定原料藥按照整個(gè)分子計(jì)算其百分含量。（同其他化學(xué)合成藥物）稀釋單位：抗生素不純時(shí)，不能用重量表示其效價(jià)，只能用稀釋單位來(lái)標(biāo)示抗生素的生物活性。用于新抗生素的初期研究第一節(jié)概述半合成新霉素、頭孢菌素類藥物純度較高，化學(xué)結(jié)構(gòu)確定，規(guī)定原料16四、抗生素標(biāo)準(zhǔn)品絕大多數(shù)抗生素效價(jià)采用微生物檢定法。要使用到標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品是具有一定物理、化學(xué)性質(zhì)及生物活性的物質(zhì)。分為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品是由英國(guó)倫敦生物標(biāo)準(zhǔn)檢定所負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)品原料的挑選、理化分析、分裝和分發(fā)等。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)的標(biāo)定由世界衛(wèi)生組織邀請(qǐng)有條件的國(guó)家檢定所或者藥廠實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，然后通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，考察標(biāo)定結(jié)果的誤差與真實(shí)性，最后由生物檢定專家委員會(huì)確定效價(jià)。我國(guó)自1976年參加了部分品種的國(guó)際協(xié)作標(biāo)定。第一節(jié)概述四、抗生素標(biāo)準(zhǔn)品絕大多數(shù)抗生素效價(jià)采用微生物檢定法。要使用到17國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品是由國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)標(biāo)定的。我國(guó)的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品是由中國(guó)藥品生物制品檢定所負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)品原料的挑選、理化分析、分裝和分發(fā)等。各種標(biāo)準(zhǔn)品都有一定的有效期，新制備的標(biāo)準(zhǔn)品開始發(fā)放，上一批的標(biāo)準(zhǔn)品停止使用。第一節(jié)概述國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品是由國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)標(biāo)定的。我國(guó)的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品是由中國(guó)18第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法一、抗生素效價(jià)測(cè)定方法

又叫微生物檢定法，是各國(guó)藥典收載的法定方法。它是以抗生素的抑制、殺死細(xì)菌的能力作為衡量效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)

物理測(cè)定法化學(xué)測(cè)定法生物測(cè)定法第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法一、抗生素效價(jià)測(cè)定方法又叫19生物測(cè)定法優(yōu)點(diǎn)：1）檢測(cè)原理與臨床應(yīng)用原理一致，檢測(cè)的結(jié)果能代表其殺菌、抑菌活性2）靈敏度高，用量極少，ug級(jí)，是其他方法所不及的3）使用范圍廣，即可用于較純的精品，也可用于粗品，對(duì)已知抗生素和位置抗生素都適用。只要按照操作規(guī)定，既可以一次測(cè)定其總效價(jià)，而不需要分離純化。生物測(cè)定法缺點(diǎn)：1）操作步驟多2）測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)3）誤差大。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法生物測(cè)定法優(yōu)點(diǎn)：第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法20物理、化學(xué)法測(cè)定效價(jià)是根據(jù)抗生素分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用其特有的物理或者化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)而進(jìn)行的測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、方便、省時(shí)、具有一定的專屬性。缺點(diǎn)：1）只能對(duì)結(jié)構(gòu)清楚、純度高的已知抗生素有效2）對(duì)未知的新抗生素，或者在發(fā)酵生產(chǎn)中未提純的樣品無(wú)法測(cè)定。只有當(dāng)用物理化學(xué)方法所測(cè)定的結(jié)果與生測(cè)結(jié)果相同時(shí)，才能用該法測(cè)定抗生素藥物的效價(jià)，這是臨床上的要求。

第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法物理、化學(xué)法測(cè)定效價(jià)是根據(jù)抗生素分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用其特有的物21第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法發(fā)展趨勢(shì)：隨著對(duì)抗生素分子結(jié)構(gòu)的逐步認(rèn)識(shí)，用物理化學(xué)方法測(cè)定效價(jià)的應(yīng)用日漸增多。如我國(guó)現(xiàn)有幾種抗生素（慶大霉素、青霉素、氯霉素、灰黃霉素）使用HPLC測(cè)定其含量，而且還分別要求了其中各個(gè)組分的含量范圍，為更好的控制其毒性提供了監(jiān)督手段。

各國(guó)藥典收載的抗生素，除了上述提及以外，其他均用微生物效價(jià)檢定法。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法發(fā)展趨勢(shì)：隨著對(duì)抗生素分子結(jié)22第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法二、抗生素效價(jià)微生物檢定法（生測(cè)法）

原理：以抑制或者殺死細(xì)菌的能力作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。是將供試液和標(biāo)準(zhǔn)液兩者抗菌能力進(jìn)行比較。分類：稀釋法比濁法擴(kuò)散法第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法二、抗生素效價(jià)微生物檢定法（23第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法1.稀釋法抗生素微生物效價(jià)測(cè)定最簡(jiǎn)單的辦法操作方法：在一系列試管中用液體培養(yǎng)基逐管將抗生素做2倍稀釋，并于各個(gè)試管中加入同量的對(duì)該抗生素高度敏感的試驗(yàn)菌液，將各個(gè)試管放置于37℃24小時(shí)，觀察能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗生素濃度作為測(cè)定終點(diǎn)。同法測(cè)定抗生素標(biāo)準(zhǔn)品終點(diǎn)，作比較，即可求出被測(cè)定抗生素的效價(jià)。計(jì)算公式A=(T/S)×CA:供試品效價(jià)T：供試品最大稀釋倍數(shù)C：標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)S：標(biāo)準(zhǔn)品最大稀釋倍數(shù)注意：這種方法終點(diǎn)判定比較困難，誤差較大，因此不是藥典收載的方法，只適用于最小抑菌濃度的測(cè)定。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法1.稀釋法抗生素微生物24第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法二、比濁法原理：細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生的濁度與細(xì)菌數(shù)量、群體質(zhì)量（生長(zhǎng)期、衰老期）及細(xì)菌細(xì)胞容積之間存在相關(guān)性，在一定范圍內(nèi)符合Beer定律。操作方法：同稀釋法相似。放置于37℃2-4小時(shí)，加入甲醛溶液（12%），搖勻（抑制細(xì)菌生長(zhǎng)），用分光光度法測(cè)定530nm透光率或者吸收度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法（先用標(biāo)準(zhǔn)品作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線），測(cè)定供試品效價(jià)。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：每個(gè)濃度測(cè)定3次第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法二、比濁法原理：細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生25第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（u/ml）24．026．830．033．537．5試驗(yàn)菌液1ml1ml1ml1ml1ml液體培養(yǎng)基9ml9ml9ml9ml9ml供試液1ml1ml1ml1ml1ml12%甲醛溶液0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml空白：未接種試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9ml+蒸餾水1ml+12%甲醛溶液0.5ml先測(cè)定各濃度3只試管吸光度，求平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線再測(cè)定供試品3只試管吸光度，求平均值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算效價(jià)。該法比較簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，日英美等國(guó)家藥典收載，我國(guó)藥典不收載。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法24．026．830．03326第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法三、擴(kuò)散法

原理：該法是采用固體瓊脂培養(yǎng)基，在融化后凝固前接入試驗(yàn)菌（多為細(xì)菌），倒平板。等凝固后，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，用不同的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，將供試品和標(biāo)準(zhǔn)品接觸于含菌的培養(yǎng)基表面，經(jīng)培養(yǎng)后，由于抗生素向培養(yǎng)基內(nèi)部擴(kuò)散，凡抑菌濃度所達(dá)到的地方都沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)“抑菌圈”。通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品抑菌圈的大小測(cè)定抗生素的效價(jià)。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法三、擴(kuò)散法原理：該法是采用27第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法分類：垂直擴(kuò)散法平面擴(kuò)散法依靠總量擴(kuò)散紙片法依靠濃度擴(kuò)散管蝶法管蝶法是國(guó)際通用的抗生素效價(jià)測(cè)定法，為各國(guó)藥典所收載，中國(guó)藥典只收載管碟法。它靈敏度高，所需要樣品少，但是操作復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)，影響結(jié)果因素多，因此要從多個(gè)環(huán)節(jié)加以嚴(yán)格控制，才能保證試驗(yàn)結(jié)果與真實(shí)值接近.第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法分類：管蝶法是國(guó)際通用的抗生28第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法1.管蝶法測(cè)定效價(jià)的原理、操作及公式推導(dǎo)

原理：利用抗生素在攤布特定試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散，形成一定濃度的含抗生素的球形區(qū)，抑制了試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)繁殖而呈現(xiàn)出透明的抑菌圈，并且在一定的范圍內(nèi)，抗生素濃度對(duì)數(shù)劑量與抑菌圈面積或者直徑成正比。在同樣條件下，將同質(zhì)的已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與未知效價(jià)的供試品溶液同時(shí)測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液對(duì)一定試驗(yàn)菌所得到的劑量反應(yīng)曲線，在一定劑量范圍內(nèi)應(yīng)互相平行。通過(guò)比較兩者抑菌圈的面積或者直徑，利用公式，求得供試品效價(jià)。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法1.管蝶法測(cè)定效價(jià)的原理、29第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法根據(jù)原理設(shè)計(jì)出一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）：適用于實(shí)驗(yàn)室研究的初級(jí)階段，因?yàn)楸旧碚`差大，不要求很準(zhǔn)。二計(jì)量法：各國(guó)藥典收載，常用于抗生素產(chǎn)品的效價(jià)測(cè)定，法定方法。三計(jì)量法：用于抗生素標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)的測(cè)定，準(zhǔn)確度最高，操作最復(fù)雜?！睹绹?guó)藥典》收載三種方法，《中國(guó)藥典》1985年后僅收載后兩種方法，并且均規(guī)定要對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法根據(jù)原理設(shè)計(jì)出30一劑量法二計(jì)量法三計(jì)量法一劑量法二計(jì)量法31第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法公式推導(dǎo)：將不銹鋼小管放置在攤布特定實(shí)驗(yàn)菌（檢定菌）的瓊脂培養(yǎng)基平板上，當(dāng)向小鋼杯內(nèi)滴加抗生素溶液后，抗生素分子就隨著溶劑向培養(yǎng)基內(nèi)呈球形擴(kuò)散。同時(shí)將培養(yǎng)基平板置于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)，試驗(yàn)菌開始繁殖?？股胤肿釉诃傊囵B(yǎng)基中的濃度隨著離開小管的距離增大而降低，當(dāng)抗生素分子擴(kuò)散到T時(shí)間，這時(shí)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)抗生素的濃度恰好等于該抗生素對(duì)試驗(yàn)菌的最小抑菌濃度，試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)繁殖受到抑制而出現(xiàn)透明的抑菌圈。在抑菌圈邊緣處，瓊脂培養(yǎng)基中所含有抗生素的濃度即為該抗生素對(duì)該試驗(yàn)菌的最小抑菌濃度。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法公式推導(dǎo)：32第八章抗生素分析課件33第八章抗生素分析課件34第八章抗生素分析課件35第八章抗生素分析課件36第八章抗生素分析課件37第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法2.二計(jì)量操作方法1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備、保存見藥典附錄2)培養(yǎng)基及其制備方法見藥典附錄3)采用的檢定菌4)供試品溶液的制備按照各藥品項(xiàng)下規(guī)定的溶劑溶解后，再按估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)?shù)臐舛鹊诙?jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法2.二計(jì)量操作方法1)標(biāo)準(zhǔn)38第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法39第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法40第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法5）操作步驟：管：不銹鋼小管（內(nèi)徑6.0mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm，外徑7.8mm±0.1mm），重量要求一致，內(nèi)外壁潔凈，不得粘有其他抗生素。攤布底層培養(yǎng)基：融化后，倒入平皿中（直徑約90mm、高16～17mm）。底層20ml，冷卻凝固。攤布上層培養(yǎng)基：融化后，冷卻至45-55℃（芽孢可至60℃），加入試驗(yàn)菌，倒入平皿中。菌層5ml，冷卻凝固。放置不鋼杯，滴加抗生素溶液與供試品溶液稀釋液。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法5）操作步驟：41第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法SH/SL=2:1或者4：1；S3/S2/S1=1：0.8:0.8×0.8蓋陶瓦蓋：防止培養(yǎng)過(guò)程中水滴回落到培養(yǎng)基或者小管中，37℃16-18小時(shí)。測(cè)量抑菌圈：手工或者抑菌圈測(cè)量?jī)x測(cè)量抑菌圈的直徑（或面積）。計(jì)算效價(jià)：帶入公式計(jì)算，抑菌圈測(cè)量?jī)x自動(dòng)計(jì)算。照生物檢定統(tǒng)計(jì)法（附錄ⅩⅣ）中的（2.2）法進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)及效價(jià)計(jì)算。本法計(jì)算所得效價(jià)，如低于估計(jì)效價(jià)的90％或高于估計(jì)效價(jià)的110％時(shí),則應(yīng)調(diào)整其估計(jì)效價(jià)，予以重試。除另有規(guī)定外，本法的可信限率不得大于5％。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法SH/SL=2:1或者42第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法要求：二劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18～22mm，三劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在15～18mm。注意：不同的國(guó)家，同一種抗生素，使用的檢定菌不完全相同。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法要求：二劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高43三、影響管蝶法效價(jià)測(cè)定結(jié)果的因素及其控制影響抑菌圈形狀的因素及控制出現(xiàn)抑菌圈破裂、不圓（橢圓或不正常形態(tài)），其原因：

稀釋抗生素的緩沖液PH值及鹽濃度制備瓊脂菌層時(shí)，加菌時(shí)培養(yǎng)基的溫度測(cè)試用實(shí)驗(yàn)器材潔凈程度培養(yǎng)溫度其他第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法三、影響管蝶法效價(jià)測(cè)定結(jié)果的因素及其控制影響抑菌圈形狀的因素441）稀釋抗生素的緩沖液PH值及鹽濃度有些抗生素溶液，若PH值低或者鹽濃度高，就會(huì)出現(xiàn)不顯抑菌圈或者呈橢圓或不正常形態(tài)，這可能是因?yàn)榭股胤肿拥慕怆x狀態(tài)發(fā)生了改變，從而抑菌作用受影響。四環(huán)素、鏈霉素都會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象。2）制備瓊脂菌層時(shí)，加菌時(shí)培養(yǎng)基的溫度溫度高，試驗(yàn)菌被燙死而造成無(wú)圈。解決辦法：依據(jù)實(shí)驗(yàn)菌的生理特性，將融化的培養(yǎng)基放在不同溫度的恒溫水浴中，待溫度平衡后，加入試驗(yàn)菌。3）測(cè)試用實(shí)驗(yàn)器材潔凈程度如果測(cè)試用的玻璃平皿、小鋼杯、鑷子等先被抗生素污染，可能出現(xiàn)抑菌圈不完整的現(xiàn)象。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法1）稀釋抗生素的緩沖液PH值及鹽濃度第二節(jié)抗生素效價(jià)微生454）培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度不均勻，造成試驗(yàn)菌生長(zhǎng)快慢不均勻，抑菌圈不圓。培養(yǎng)溫度不均勻，抗生素的擴(kuò)散系數(shù)不同，抑菌圈不圓。解決辦法：培養(yǎng)箱內(nèi)要溫度均一，平皿放在同一層內(nèi)，不要過(guò)多開啟培養(yǎng)箱5）其他抗生素滴加到小鋼杯外，或者濺到小鋼杯外，抑菌圈不圓。小鋼杯底部與培養(yǎng)基表面接觸不嚴(yán)，漏液，抑菌圈不圓。小鋼杯放置太近，抑菌圈擴(kuò)散到一起，抑菌圈不圓。平皿內(nèi)培養(yǎng)基厚度不同，抑菌圈不圓。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法4）培養(yǎng)溫度第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法46第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法2.影響抑菌圈邊緣清晰度的因素及控制抑菌圈不清楚，模糊、不光滑、鋸齒、雙圈，其原因是：

試驗(yàn)菌放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)菌層中含菌量過(guò)低培養(yǎng)基原材料的影響培養(yǎng)基pH值及鹽濃度的影響培養(yǎng)時(shí)間的影響第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法2.影響抑菌圈邊緣清晰度的47第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法1）試驗(yàn)菌放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)試驗(yàn)菌放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌群內(nèi)一些菌株生理特性有改變，如生長(zhǎng)速度不同（有先長(zhǎng)，后長(zhǎng)），或者對(duì)抗生素敏感度不同，從而出現(xiàn)雙圈，抑菌圈邊緣不圓。這是由于C’變化r2改變（lgM=1/9.21DT*r2+lgC’*4πDTH）。解決辦法：定期對(duì)實(shí)驗(yàn)菌純化，試驗(yàn)菌必須是純種的，使其處于同一生理狀態(tài)。在挑取單菌落的時(shí)候，球菌要取光滑型，芽孢桿菌挑取粗慥型，傳斜面。斜面培養(yǎng)好后，用無(wú)菌水洗下菌苔，過(guò)濾。芽孢要60-65℃處理30分鐘。鏡檢觀察，單個(gè)菌分散度在90%以上。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法1）試驗(yàn)菌放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)48第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法2）菌層中含菌量過(guò)低抑菌圈邊緣不清，含菌量高，抑菌圈太小，影響靈敏度。解決辦法：在正式實(shí)驗(yàn)前，找出最適菌濃。解決辦法：預(yù)實(shí)驗(yàn)3）培養(yǎng)基原材料的影響蛋白胨、酵母膏、瓊脂等都能影響抑菌圈的大小與清晰度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛋白胨選取魚胨、骨胨、雞肉胨要好于肉胨、蛋胨。酵母膏中含有維生素B，不僅影響試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)，還影響某些抗生素的抗菌活性。如氯霉素效價(jià)測(cè)定，培養(yǎng)基中含有維生素B,抑菌圈較為清晰。瓊脂的質(zhì)量與加量能影響抑菌圈的質(zhì)量。不同瓊脂的機(jī)械強(qiáng)度、凝固點(diǎn)、雜質(zhì)種類和數(shù)量等等都不同，都會(huì)對(duì)試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)以及抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù)，導(dǎo)致抑菌圈的模糊不清，不圓等現(xiàn)象。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法2）菌層中含菌量過(guò)低49第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法4）培養(yǎng)基pH值及鹽濃度的影響調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH或者適量增加鹽濃度可以使抑菌圈清晰。如堿性抗生素在偏堿性的培養(yǎng)基和緩沖液中，抗菌活性強(qiáng)，抑菌圈清晰。如酸性抗生素在偏酸性的培養(yǎng)基和緩沖液中，抗菌活性強(qiáng)，抑菌圈清晰。慶大霉素、新霉素緩沖液中增加3%的NaCl，使分子擴(kuò)散加快，抑菌圈大而清晰。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法4）培養(yǎng)基pH值及鹽濃度的影50第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法5）培養(yǎng)時(shí)間的影響

不適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)雙蝶的培養(yǎng)時(shí)間，使抑菌圈邊緣不清，這是因?yàn)槟承┛股刂皇且种圃囼?yàn)菌的生長(zhǎng)，當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，細(xì)菌總量增加，抗生素隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降解，抑菌圈邊緣的細(xì)菌便會(huì)向圈內(nèi)生長(zhǎng)，致使抑菌圈變小，邊緣不清。第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法5）培養(yǎng)時(shí)間的影響513.標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的質(zhì)要相同效價(jià)計(jì)算公式是以標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的質(zhì)相同為前提推導(dǎo)而來(lái)的，因此在操作的時(shí)候要確保這一點(diǎn)。如標(biāo)準(zhǔn)品與供試品要相同，稀釋用的緩沖液（PH、鹽濃度）要相同。如供試品中含有某種可能影響效價(jià)測(cè)定的雜質(zhì)，那么在標(biāo)準(zhǔn)品溶液中要相應(yīng)的添加這種雜質(zhì)，以抵消影響。如鹽酸四環(huán)素制劑中含有維生素C，則標(biāo)準(zhǔn)品種也要添加維生素C第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法3.標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的質(zhì)要相同效價(jià)計(jì)算公式是以標(biāo)準(zhǔn)品與供試品524.抗生素最后稀釋濃度與抑菌圈直徑的關(guān)系由公式lgM=1/9.21DT×r2+lgC’×4πDTH得出，抗生素最后稀釋液的濃度與抑菌圈半徑平方值之間在一定的劑量范圍內(nèi)呈直線關(guān)系（劑量反應(yīng)直線）。為了簡(jiǎn)化計(jì)算過(guò)程，常以直徑代替半徑平方來(lái)計(jì)算。如果供試品的效價(jià)估計(jì)不準(zhǔn)，仍可用半徑平方來(lái)計(jì)算，這樣線性范圍寬一些。如果抗生素在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，最后稀釋濃度發(fā)生變化（如抗生素被破壞或被培養(yǎng)基中某些雜質(zhì)吸附，被試驗(yàn)菌吸附等等），都能使計(jì)量反應(yīng)直線的距離縮短。解決辦法：調(diào)節(jié)稀釋用的緩沖液pH值、培養(yǎng)基pH值、去除某些雜質(zhì)、選取靈敏度高的試驗(yàn)菌等

第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法4.抗生素最后稀釋濃度與抑菌圈直徑的關(guān)系由公式lgM=1/535.直線的斜率與截率由公式lgM=1/9.21DT×r2+lgC’×4πDTH得出，如果斜率1/9.21DT小，r大；抗生素的劑量稍作改變，Δr變化很大，靈敏度高。若使1/9.21DT小D大，T大D:與抗生素分子量（固定）、培養(yǎng)基成分、緩沖液PH、鹽濃度、瓊脂含量、試驗(yàn)菌量及試驗(yàn)菌是否吸附抗生素有關(guān).T:控制培養(yǎng)基成分或者降低培養(yǎng)基PH，使其偏酸（PH>4.5），生長(zhǎng)緩慢。降低溫度（鋪好菌的雙蝶預(yù)先冷卻在滴加抗生素，或者滴加抗生素后，室溫放置半小時(shí)以上，再放入恒溫培養(yǎng)箱中。）但是培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，抗生素可能要分解，對(duì)抑菌圈清晰度與實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度都有影響.第二節(jié)抗生素效價(jià)微生物檢定法5.直線的斜率與截率由公式lgM=1/9.21DT×r2+54截距

lgC’×4πDTH小，對(duì)于一定劑量的抗生素來(lái)說(shuō)，抑菌圈變大，靈敏度高。除了D\T\C’對(duì)截距有影響外，H（培養(yǎng)基厚度）也是重要的影響因素。由此可見，H1/2H抑菌圈直徑增大，靈敏度高，這是薄層法測(cè)定微量抗生素濃度的原理。如血液中、食品、制劑中抗生素，樣品經(jīng)過(guò)高度稀釋后，雜質(zhì)、輔料的影響減少，可以較準(zhǔn)確地測(cè)定抗生素的含量截距l(xiāng)gC’×4πDTH小，對(duì)于一定劑量的抗生素來(lái)說(shuō)，抑菌55第三節(jié)抗生素藥物的分析、β-內(nèi)酰胺類抗生素（一)鑒別1、生物學(xué)鑒別法-青霉素酶法實(shí)驗(yàn)2、化學(xué)法-呈色反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、有機(jī)胺鹽反應(yīng)3、光譜法-IR法、UV法、核磁共振光譜4、色譜法-TLC、HPLC(二)檢查1、聚合物2、有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體3、雜質(zhì)吸收度的檢查(三)含量測(cè)定1、碘量法2、電位配位滴定法（汞量法）3、HPLC第三節(jié)抗生素藥物的分析、β-內(nèi)酰胺類抗生素（一)鑒別56青霉素類典型的β–內(nèi)酰胺類抗生素特點(diǎn)：含有β-lactamring;四氫噻唑或者二氫噻嗪環(huán)青霉素類典型的β–內(nèi)酰胺類抗生素特點(diǎn)：含有β-lactam57頭孢菌素類7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基頭孢烯酸）RCO頭孢菌素類7654321NONHSCH2R1COOH母核（7581、生物學(xué)鑒別法——青霉素酶法實(shí)驗(yàn)原理：用青霉素酶水解青霉素類抗生素而失去抗菌活性，再用對(duì)青霉素類抗生素敏感菌—金黃色葡萄球菌試驗(yàn)其是否喪失抗菌活性，即是否發(fā)生水解反應(yīng)，如果已失去抗菌活性，證明供試品已被酶水解，供試品為青霉素類藥物。本試驗(yàn)需要同時(shí)作對(duì)照實(shí)驗(yàn)，即取供試液與標(biāo)準(zhǔn)液，一部分用酶滅活，另一部分保存。同時(shí)使用濾紙片測(cè)定生物學(xué)活性。經(jīng)過(guò)滅活的不應(yīng)有抑菌圈，而未經(jīng)滅活的有抑菌圈。1、生物學(xué)鑒別法——青霉素酶法實(shí)驗(yàn)592.化學(xué)法1）呈色反應(yīng)—羥肟酸鐵反應(yīng)H+Fe3+/3（紅、棕、褐）2.化學(xué)法1）呈色反應(yīng)—羥肟酸鐵反應(yīng)H+Fe3+/3（紅602)呈色反應(yīng)—類似肽鍵的反應(yīng)△茚三酮反應(yīng)2)呈色反應(yīng)—類似肽鍵的反應(yīng)△茚三酮反應(yīng)61α-氨基、伯胺某些羥基胺類酮式烯醇式茚三酮茚三酮縮合藍(lán)紫色α-氨基、伯胺酮式烯醇式茚三酮茚三酮縮合藍(lán)紫色62（開環(huán)分解）似肽鍵3）呈色反應(yīng)----雙縮脲反應(yīng)（開環(huán)分解）似肽鍵3）呈色反應(yīng)----雙縮脲反應(yīng)63藍(lán)紫色藍(lán)紫色644）呈色反應(yīng)----與變色酸-硫酸反應(yīng)青霉素阿莫西林氨芐西林活潑“-CH2-”△（分解）變色酸顯色4）呈色反應(yīng)----與變色酸-硫酸反應(yīng)活潑“-CH2-”△（65150℃（縮合）150℃（縮合）66（縮合）1,8-二羥基-3,6-萘二磺酸1,8-二羥基-3,6-萘二磺酸

（縮合）1,8-二羥基-3,6-萘二磺酸1,8-二羥基-3675）呈色反應(yīng)----與重氮苯磺酸反應(yīng)

頭孢哌酮—酚羥基（偶合）5）呈色反應(yīng)----與重氮苯磺酸反應(yīng)（偶合）68（偶合）（偶合）69第八章抗生素分析課件706）呈色反應(yīng)----與H2SO4-HNO3反應(yīng)頭孢菌素類6）呈色反應(yīng)----與H2SO4-HNO3反應(yīng)頭孢菌素類717）呈色反應(yīng)----與銅鹽反應(yīng)橄欖綠色NaOH專屬反應(yīng)7）呈色反應(yīng)----與銅鹽反應(yīng)橄欖綠色NaOH專屬反應(yīng)728）呈色反應(yīng)----K+、Na+反應(yīng)焰色→鮮黃色+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+

焰色→紫色+0.1%四苯硼鈉+Ac→↓白

K+8）呈色反應(yīng)----K+、Na+反應(yīng)焰色739）沉淀反應(yīng)遇酸→↓有機(jī)溶劑中溶解9）沉淀反應(yīng)遇酸→↓有機(jī)溶劑中溶解7410）有機(jī)胺鹽反應(yīng)重氮化-偶合反應(yīng)重氮化-偶合反應(yīng)芳伯氨基10）有機(jī)胺鹽反應(yīng)重氮化-偶合反應(yīng)重氮化-偶合反75普魯卡因普魯卡因青霉素普魯卡因普魯卡因青霉素76第八章抗生素分析課件77與三硝基苯酚反應(yīng)△二芐基乙二胺與三硝基苯酚反應(yīng)△二芐基乙二胺78mp三硝基苯酚mp三硝基苯酚793.光譜法1）IR法2）UV法3）核磁共振光譜3.光譜法1）IR法80阿莫西林的紅外光譜圖阿莫西林的紅外光譜圖81β-內(nèi)酰胺環(huán)酰胺青霉素β-內(nèi)酰胺環(huán)酰胺青霉素822、UV法樣品、分解產(chǎn)物Cu2+頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉A280nm/A264nm=1.30～1.502、UV法樣品、分解產(chǎn)物Cu2+頭孢氨芐λmax83取本品，加醋酸-醋酸鈉緩沖溶液pH3.8，制成50ug/ml的溶液，取10ml，水浴加熱，以未加熱的共試品為空白。測(cè)定，吸收度0.6。取本品，加醋酸-醋酸鈉緩沖溶液pH3.8，制成5084Cu2+pH3.8△Cu2+pH3.8△85第八章抗生素分析課件86氯唑青霉素3410.682雙氯青霉素3420.653苯唑青霉素3391.328(nm)氯唑青霉素3410.874.色譜法對(duì)照品對(duì)照法1）TLC法2)HPLC法4.色譜法對(duì)照品對(duì)照法1）TLC法2)HPLC法88二、檢查（一）聚合物中國(guó)藥典規(guī)定，頭孢曲松，哌酮，噻肟需檢查聚合物。用HPLC，以他啶為例。二、檢查89對(duì)照溶液的制備取對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成100ug/ml溶液，搖勻。對(duì)照溶液的制備取對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成190測(cè)定法取供試品適量，精密稱定，加水制成，20ug/ml進(jìn)樣。含聚合物不得超過(guò)頭孢他定的0.3%。測(cè)定法取供試品適量，精密稱定，加水制成，20ug91

（二）有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體頭孢氨芐中有關(guān)物質(zhì)的檢查（反相TLC法）頭孢氨芐以青霉素鉀為原料，經(jīng)氧化、擴(kuò)環(huán)、裂解得7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸（7-ADCA），再與側(cè)鏈a-苯甘氨酸縮合而成。這兩種原料有可能成為主要雜質(zhì)。用茚三酮顯色，a-苯甘氨酸和7-ADCA斑點(diǎn)顯橙黃色。（二）有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體92（三）雜質(zhì)吸收度的檢查青霉素鈉（鉀）：取本品，加水，1.80mg/ml。280nm不得大于0.10，264nm應(yīng)為0.80-0.88。264nm的吸收值用來(lái)控制青霉素鈉（鉀）的含量。280nm的吸收用來(lái)控制雜質(zhì)。（三）雜質(zhì)吸收度的檢查93四、三、含量測(cè)定碘量法（一）ChP利用其分子本身不消耗碘，而降解產(chǎn)物消耗碘，用剩余碘量法測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法計(jì)算。四、三、含量測(cè)定碘量法（一）ChP利用其分子本身94（水解）原理水解產(chǎn)物定量過(guò)量剩余（水解）原理水解產(chǎn)物定量過(guò)量剩余95反應(yīng)分兩步進(jìn)行：水解反應(yīng)(按化學(xué)計(jì)算量進(jìn)行)氧化-還原反應(yīng)(無(wú)固定的量關(guān)系，受溫度、PH值和時(shí)間等因素影響，應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)條件并采用標(biāo)準(zhǔn)品平行對(duì)照測(cè)定)反應(yīng)分兩步進(jìn)行：96第一步第二步第一步第二步97例注射用普魯卡因青霉素含量測(cè)定取裝量差異項(xiàng)（藥典附錄P7）下的內(nèi)容物，精密稱取約0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氫氧化鈉溶液1ml放置20分鐘，例注射用普魯卡因青霉素含量測(cè)定取裝量差異項(xiàng)（藥典附錄98再加1mol/L鹽酸溶液1ml與醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.5)5ml，精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，搖勻，在20～25℃暗處放置20分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定，再加1mol/L鹽酸溶液1ml與醋酸-醋酸鈉緩沖99至近終點(diǎn)時(shí)加淀粉指示液，繼續(xù)滴定并強(qiáng)力振搖，至藍(lán)色消失；另精密量取供試品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，搖勻，至近終點(diǎn)時(shí)加淀粉指示液，繼續(xù)滴定并強(qiáng)力振搖，至藍(lán)色消失；另精100在暗處放置20分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定，作為空白。同時(shí)用青霉素鈉對(duì)照品同法測(cè)定作對(duì)照，算出供試品的含量。在暗處放置20分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）101V樣空V樣對(duì)照液+緩沖液+碘液+回滴+堿+酸+緩沖液+碘液+回滴V對(duì)空V對(duì)供試液+緩沖液+碘液+回滴+堿+酸+緩沖液+碘液+回滴2.方法V樣空V樣對(duì)照液+緩沖液+碘液+回滴V對(duì)空V對(duì)供試液+緩沖液102空白試驗(yàn)A、消除樣品已降解產(chǎn)物的干擾B、消除樣品中其他消耗碘的雜質(zhì)的干擾C、消除碘揮發(fā)造成的誤差以未經(jīng)水解的樣品作空白測(cè)定空白試驗(yàn)A、消除樣品已降解產(chǎn)物的干擾以未經(jīng)水解的樣品作103空白樣品I2Na2S2O3I-I2空白樣品I2Na2S2O3I-I2104采用標(biāo)準(zhǔn)品平行對(duì)照測(cè)定A、可消除溫度、pH、操作、環(huán)境等條件的影響B(tài)、使本法測(cè)定結(jié)果與微生物檢定法一致采用標(biāo)準(zhǔn)品平行對(duì)照測(cè)定A、可消除溫度、pH、操作、環(huán)1053.條件（1）弱酸性pH4.5堿↑I2→IO3-+I-酸↑普魯卡因與碘在酸性條件下會(huì)產(chǎn)生復(fù)鹽沉淀（2）溫度24～26℃溫度＞38℃未水解的供試品亦消耗碘3.條件106（3）水解時(shí)間以水解20分鐘后的耗碘量最大（4）反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)20分鐘后，耗碘量隨時(shí)間的變化較小，可減小含量測(cè)定的誤差。（3）水解時(shí)間107（1）靈敏度高樣品:碘=1:8（2）反應(yīng)條件、實(shí)驗(yàn)操作要求高V對(duì)、V對(duì)空V樣、V樣空1份含量4I2→8I-4.特點(diǎn)加試劑次序、反應(yīng)時(shí)間、滴定速度相同（1）靈敏度高樣品:碘=1:8（2）反應(yīng)條件1085.計(jì)算原料5.計(jì)算原料109降解產(chǎn)物或雜質(zhì)可消耗碘而影響測(cè)定，因此用未經(jīng)水解的樣品做空白。碘量法是青霉素族的經(jīng)典的測(cè)定方法。降解產(chǎn)物或雜質(zhì)可消耗碘而影響測(cè)定，因此用未經(jīng)水解的樣品做空白110酸堿滴定法（二）1、原理△（鈉鹽）β-內(nèi)酰胺類ChP酸堿滴定法（二）1、原理△（鈉鹽）β-內(nèi)酰胺類ChP111△△1122、方法△中和中和2、方法△中和中和113例苯唑西林鈉含量測(cè)定取本品約0.5g，精密稱定，加新沸過(guò)的并用0.01mol/L氫氧化鈉溶液中和至酚酞指示液剛顯紅色的水20ml，使溶解,再用0.01mol/L氫氧化鈉溶液中和后，例苯唑西林鈉含量測(cè)定取本114精密加氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)25ml，搖勻，置水浴中加熱20分鐘，注意避免吸收空氣中的二氧化碳，冷卻后，加酚酞指示液1～2滴，用鹽酸滴定液精密加氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)25ml，搖勻，置115（0.1mol/L）滴定，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml的氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于40.14mgC19H19N3O5S。（0.1mol/L）滴定，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1m1163、討論（1）水解前先中和溶劑和樣品（2）加熱時(shí)避免吸收CO2△不能使酚酞變紅（3）空白試驗(yàn)校正(消除Na2CO3干擾)（4）特點(diǎn)簡(jiǎn)便快速，不適用于有殘留酯的產(chǎn)品3、討論（1）水解前先中和溶劑和樣品（2）加熱時(shí)避免吸收CO117

1.原理（水解）ChP青霉素族（三）電位配位滴定法（汞量法）1.原理（水解）ChP青霉素族（三）電位配位滴定法1182.方法醋酸鹽緩沖液pH4.6滴定水解pH4.6滴定樣品以未經(jīng)水解的樣品作空白測(cè)定2.方法醋酸鹽緩沖液pH4.6滴定水解pH4.6滴定樣以未119例苯唑西林鈉含量測(cè)定取本品約50mg，精密稱定，加水5ml溶解后，加1mol/L氫氧化鈉溶液5ml，搖勻，放置15分鐘，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸鹽緩沖液(pH4.6)20ml及水20ml，搖勻，例苯唑西林鈉含量測(cè)定取本品約50mg120照電位滴定法(附錄ⅦA),用鉑電極為指示電極，汞-硫酸亞汞電極為參比電極，在35～40℃，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)緩慢滴定，照電位滴定法(附錄ⅦA),121（控制滴定過(guò)程約為15分鐘），不計(jì)第一個(gè)等當(dāng)點(diǎn)，計(jì)算第二個(gè)等當(dāng)點(diǎn)時(shí)消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相當(dāng)于8.029mg的總苯唑西林(按C19H19N3O5S計(jì)算)。（控制滴定過(guò)程約為15分鐘），不計(jì)第一個(gè)等當(dāng)點(diǎn)，計(jì)算第二個(gè)等122另取本品約0.5g，精密稱定，加水與上述醋酸鹽緩沖液各25ml，振搖使完全溶解，在室溫下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，終點(diǎn)判斷方法同上。另取本品約0.5g，精密稱定，加水與上述醋酸鹽緩沖液各25m123每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相當(dāng)于8.029mg的降解物（按C19H19N3O5S計(jì)算）?？偙竭蛭髁值陌俜趾颗c降解物的百分含量之差值即為苯唑西林的含量。每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相當(dāng)于8.029m1243、討論（1）水解必須完全（2）空白試驗(yàn)消除已降解產(chǎn)物干擾（4）優(yōu)點(diǎn)不需標(biāo)準(zhǔn)品（2）反應(yīng)摩爾比1:13、討論1254、計(jì)算4、計(jì)算126（1）原理（咪唑）ChP青霉素族（五）可見-紫外分光光度法1、硫醇汞鹽法（1）原理（咪唑）ChP青霉素族（五）可見-紫外分光光度127咪唑咪唑128（2）方法對(duì)照品法計(jì)算pH9（2）方法對(duì)照品法計(jì)算pH9129例氨芐西林鈉含量測(cè)定取本品約60mg置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置另一100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5ml，置25ml量瓶中，加硼酸緩沖液2.5ml與醋酐的乙腈溶液（1→50）0.25ml，放置5min后，加咪唑溶液至刻度，搖勻，置60℃水浴例氨芐西林鈉含量測(cè)定取本品約60mg置100m130中，加熱30min，取出冷卻，照分光光度法（附錄ⅣA），在325nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度；另取氨芐西林三水合物標(biāo)準(zhǔn)品，按同法測(cè)定，計(jì)算，即得。

中，加熱30min，取出冷卻，照分光光度法（附錄ⅣA），131（3）討論咪唑催化的水解產(chǎn)率高，硫醇汞鹽穩(wěn)定（≥3h）b.側(cè)鏈有-NH2時(shí)，需加醋酐先將其乙?；蟛拍馨l(fā)生上述反應(yīng)（3）討論咪唑催化的水解產(chǎn)率高，b.側(cè)鏈有-NH2時(shí)，需加132pH9pH9133（4）特點(diǎn)A、簡(jiǎn)便快速B、用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，重現(xiàn)性良好，RSD≤1%（4）特點(diǎn)A、簡(jiǎn)便快速134（水解）穩(wěn)定劑青霉素族2、酸水解法（銅鹽法）（1）原理（水解）穩(wěn)定劑青霉素族135第八章抗生素分析課件136（2）方法△（3）特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件隨各藥物穩(wěn)定性不同而定標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法（2）方法△（3）特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件隨各藥物穩(wěn)定性不同而定標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)137（4）計(jì)算（4）計(jì)算138Fe3+/3H+紅色β-內(nèi)酰胺類NaOH3、羥肟酸比色法Fe3+/3H+紅色β-內(nèi)酰胺類NaOH3、羥肟酸比色法139（六）HPLC法頭孢菌素類內(nèi)標(biāo)法＋校正因子外標(biāo)法特點(diǎn)快速、高效、靈敏專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好一法多用（鑒別、檢查、含測(cè)）（六）HPLC法頭孢菌素類特點(diǎn)快速、高效、靈敏140第三節(jié)氨基糖苷類抗生素鏈霉素雙氫鏈霉素新霉素卡那霉素慶大霉素巴龍霉素第三節(jié)氨基糖苷類抗生素鏈霉素雙氫鏈霉素141鏈霉胍

+

鏈霉糖

+

N-甲基-L-葡萄糖胺

苷元糖鏈霉雙糖胺鏈霉素鏈霉胍+鏈霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺142鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-143鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-144

糖苷元絳紅糖胺+脫氧鏈霉胺+加洛糖胺

糖慶大霉素糖苷元絳紅糖胺+脫氧鏈霉胺+加洛糖145絳紅糖胺紫素胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺絳紅糖胺紫素胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-146慶大霉素C復(fù)合物慶大霉素C1R=HR1、R2=CH3慶大霉素C2R=R2=H

R1=CH3慶大霉素C1aR、R1、R2=H慶大霉素C2aR=CH3R1=R2=H慶大霉素C2bR=R1=HR2=CH3慶大霉素C復(fù)合物147一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)鏈霉素3個(gè)慶大霉素5個(gè)堿性中心（一）堿性與溶解性多與硫酸成鹽溶解性：水溶性一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)鏈霉素3個(gè)慶大霉素5個(gè)堿性中心（一）堿148鏈霉素pH5～7.5慶大霉素pH2～12穩(wěn)定UV（四）（三）穩(wěn)定性與鏈霉素水解產(chǎn)物反應(yīng)旋光性（二）鏈霉素pH5～7.5穩(wěn)定UV（四）（三）穩(wěn)定性與鏈霉149坂口反應(yīng)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)坂口反應(yīng)N-甲基葡萄麥芽酚反應(yīng)150△二、鑒別（一）茚三酮反應(yīng)羥基胺結(jié)構(gòu)取慶大霉素5mg水1ml，0.1%茚三酮的水飽和正丁醇溶液1ml,吡啶0.5ml,水浴加熱5min,顯紫色?！鞫?、鑒別（一）茚三酮反應(yīng)羥基胺結(jié)構(gòu)取慶大霉素5mg水1m151（二）Molisch試驗(yàn)具有五碳糖或六碳糖結(jié)構(gòu)的氨基糖苷類抗生素經(jīng)酸水解后，在鹽酸或硫酸作用下脫水，成糠醛（五碳）或羥甲基糠醛（六碳糖）。這些產(chǎn)物遇a-萘酚或蒽酮成色。（二）Molisch試驗(yàn)152乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對(duì)二甲氨基苯甲醛H+紅色（Elson-Morgan反應(yīng)）（三）N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對(duì)二甲氨基苯甲醛H+紅色（Elson153(縮合)(縮合)154紅色對(duì)二甲氨基苯甲醛H+紅色對(duì)二甲氨基苯甲醛H+155

鏈霉糖特有反應(yīng)H+分子重排（四）麥芽酚（Maltol）反應(yīng)鏈霉糖特有反應(yīng)H+分子重排（四）麥芽酚（Malto156紫紅麥芽酚紫紅麥芽酚157鏈霉胍特有反應(yīng)（或α-萘酚）8-羥基喹啉坂口反應(yīng)（五）α-萘酚鏈霉胍特有反應(yīng)（或α-萘酚）8-羥基喹啉坂口反應(yīng)（五）α-158第八章抗生素分析課件159（六）反應(yīng)H+（八）光譜法IR法慶大霉素?zé)oUV吸收（七）TLC法UV法（六）反應(yīng)H+（八）光譜法慶大霉素?zé)oUV吸收（七）TLC160方法TLC中的對(duì)照品法（BP）1.來(lái)源反應(yīng)中間體三、特殊雜質(zhì)檢查及組分分析（一）鏈霉素中鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）雜質(zhì)方法TLC中的對(duì)照品法1.來(lái)源反應(yīng)中間體三、161（二）硫酸奈替米星(乙基西索米星)中有關(guān)物質(zhì)的檢查（略）（二）硫酸奈替米星(乙基西索米星)中有關(guān)物質(zhì)的檢查（略）162對(duì)微生物的活性無(wú)明顯差異毒副作用和耐藥性不同發(fā)酵菌種不同工藝差別C組分比例不一致規(guī)定控制各組分的相對(duì)百分含量ChPUSPBPJP（三）慶大霉素C組分的測(cè)定對(duì)微生物的活性無(wú)明顯差異毒副作用和耐藥性不同發(fā)酵菌種不同C組163λmax=330nm1.衍生化原理λmax=330nm1.衍生化原理1641-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物1-烷基硫代-2-烷基165

規(guī)定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%3.計(jì)算峰面積歸一化法2.方法RP－HPLC規(guī)定C125~50166第八章抗生素分析課件167四、含量測(cè)定1.微生物檢定法管碟法參照藥典附錄操作。如鏈霉素：試驗(yàn)菌：枯草芽孢桿菌（63501）培養(yǎng)基：I稀釋用緩沖液Ph7.8-8.0,最終稀釋濃度0.6-1.6u/ml四、含量測(cè)定1682.HPLC方法（慶大霉素Ｃ組分測(cè)定）利用慶大霉素C組分結(jié)構(gòu)中的伯氨基同鄰苯二醛、巰基醋酸在pH10.4硼酸鹽緩沖液中反應(yīng)，生成1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物，在330nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收。2.HPLC方法（慶大霉素Ｃ組分測(cè)定）利用慶大霉素C組分169三、四環(huán)素類抗生素ABCD三、四環(huán)素類抗生素ABCD170123456789101112123456789101112171四環(huán)素（TC）tetracycline四環(huán)素（TC）tetracycline172金霉素(CTC)

chlortetracycline氯四環(huán)素金霉素(CTC)chlortetracycline氯四環(huán)173土霉素(OTC)

oxytetracycline氧四環(huán)素土霉素(OTC)oxytetracycline氧四環(huán)174多西環(huán)素(DOTC)doxycycline脫氧土霉素多西環(huán)素(DOTC)doxycycline脫氧土霉175美他環(huán)素（METC）metacycline美他環(huán)素（METC）metacycline176第八章抗生素分析課件177一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.與酸、堿均能成鹽2.強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中溶解度↑

酚羥基、烯醇型羥基

弱酸性二甲胺基

弱堿性（一）酸堿性與溶解度兩性一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.與酸、堿均能成鹽2.強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中溶解度↑178具有吸濕性，多含結(jié)晶水與金屬離子生成有色配位化合物Ca2+Mg2+Fe3+Al3+UV（三）pH3~7.5