食用菌栽培課件24

食用菌栽培課件24第九章菌種的分離、提純、擴大、培養(yǎng)與保第一節(jié)菌種的分離與提純進入課文三、菌種的提純?nèi)绻蛛x的菌種已污染，可以使用相應的辦法除掉。

(一)使用抑制培養(yǎng)基(二)排除細菌或酵母菌污染(三)排除霉菌污染(四)菌絲再提純(五)單根菌絲提純技術(六)菌絲生長速度、生長量的測試使用抑制培養(yǎng)基從腐朽嚴重的木材塊上分離菌絲時，新生菌常會伴隨著各種各樣的細菌、霉菌出現(xiàn)。在這種情況下，可向培養(yǎng)基中加入選擇性強的抗菌劑，如涕必靈(TBZ)或多菌靈(MBC)。抗細菌的如培養(yǎng)基加入30mg/L左右的四環(huán)素或氯霉素等，以抑制細菌的出現(xiàn)。此外，也可以在培養(yǎng)基內(nèi)添加鏈霉素30～40mg/L或金霉素20～30mg/L或高錳酸鉀50mg/L。返回排除細菌或酵母菌污染

組織分離，基內(nèi)菌絲分離將分離物接種在無冷凝水、硬度較高的斜面培養(yǎng)基上，再降低培養(yǎng)溫度至15～20℃。利用某些大型真菌在較低的溫度下，菌絲生長速度比細菌菌苔蔓延速度快的特點，用尖細的接種針切割菌絲的前端，轉接到新的試管斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)2～3次就能獲得所要的純菌絲。也可以用接種鏟將斜面污染的細菌菌苔鏟除掉，打破試管，挑取內(nèi)部有基內(nèi)菌絲的瓊脂塊，移入無冷凝水的培養(yǎng)基上。適合于菌齡較長、被好氣性細污染的試管。

返回排除霉菌污染分離培養(yǎng)后，若發(fā)現(xiàn)有色的霉菌小斑點污染，最好放棄。如由同一材料分離得來的，每支試管都是如此，那就要重新分離。如果霉菌菌落剛出現(xiàn)孢子，孢子尚未成熟，尚未變色，則可采用前端菌絲切割法提純。如果霉菌菌落的顏色已加深，則意味著眾多的孢子已成熟，若采用前端菌絲切割法提純意義不大?？蓪?%多菌靈的濕濾紙蓋在霉菌的菌落上，以防止提純時，試管振動使孢子擴散。然后，用火焰滅菌過的接種鏟將分離物表層鏟掉，隨之，用另一接種針鉤取分離物位置下的基內(nèi)菌絲。霉菌的污染還常見于棉塞上，這多是棉塞受潮所致。返回(四)菌絲再提純采用切割法或基內(nèi)菌絲挑取法提純后，一般都能獲得純菌絲，但也偶有提而不純的現(xiàn)象發(fā)生，這就必須對菌絲再提純。為了判斷提純后菌落的純度，將菌絲塊接入瓊脂培養(yǎng)皿平板培養(yǎng)基內(nèi)，如果純種菌絲，菌落會逐漸向四周輻射狀散開，外緣整齊，如果菌種不純，混有其它絲狀真菌，菌絲生長速度不一，菌落外緣便參差不齊，培養(yǎng)皿內(nèi)產(chǎn)生的色素也分布不勻。再提純時，對菌落中生長速度較為一致的部分施行菌絲前端切割，移植至新的培養(yǎng)基。返回單根菌絲提純技術將懷疑混有雜菌的菌絲，用尖細的接種針切割帶有培養(yǎng)基的菌落前端2～3mm2的薄片，移接入PDA培養(yǎng)基，每支試管可移接數(shù)點，放在所分離的菌種的最隹溫度下培養(yǎng)，隔12小時后，在陽光下觀察各接種塊菌絲生長的狀態(tài)。選取菌絲顯現(xiàn)出分叉狀，用鋒利的接種針仔細地將貼在培養(yǎng)基面上的單根菌絲帶培養(yǎng)基切割下來，移入PDA培養(yǎng)基內(nèi)，塞上棉塞，再用放大鏡觀察判斷是否為單根菌絲，則應繼續(xù)培養(yǎng)12～24小時后，再重復上述過程。適合于菌絲生長速度快，密度不高的菌類，如草菇返回菌絲生長速度、生長量的測試菌絲生長速度或生長量的測定常用于判斷菌種生長能力的優(yōu)劣或在不同營養(yǎng)、環(huán)境條件下適應能力的高低。將適合測試菌類的培養(yǎng)基填入25㎜×25㎜試管內(nèi)，取略小于試管口徑的小木棒輕輕插入，豎立，在木棒上方加適當?shù)闹亓?。再抽出木棒，洗凈試管口，擦干，塞上棉塞，置入手提式高壓滅菌鍋中，常?guī)方法滅菌。滅菌時間為1小時，取出冷卻，即成相接近密度的培養(yǎng)基柱。下一頁菌絲生長速度、生長量的測試在無菌條件下，接入菌齡長短一致，接種塊大小盡量一致的菌絲塊。豎放并適溫培養(yǎng)。待菌絲蔓延1cm左右，用記號筆在試管上沿菌絲前沿畫線。數(shù)日培養(yǎng)后，再劃出終止線，這樣就容易計算出日生長速度。每樣品重復3次。通過不同樣品間的比較，就能從中棄弱留強。但必須指出，菌絲生長速度量快的，并非出菇最快。產(chǎn)量與質(zhì)量皆好的菌株，還要進一步做試驗，確定。第二節(jié)菌種的擴大、培養(yǎng)一、菌種的擴大經(jīng)分離、提純、出菇試驗確定為生產(chǎn)用種后，為了適應生產(chǎn)栽培需要，要進行菌種的擴大、繁殖。二、貼標簽無論是菌種分離、提純，還是一級、二級或三級種的擴大，無菌操作后應馬上貼標簽。三.菌種培養(yǎng)培養(yǎng)室內(nèi)溫度、濕度、光照、空氣等條件彼此聯(lián)系，互相影響。(一)一級菌種的擴大培養(yǎng)1.單一菌絲類型一級菌種的擴大培養(yǎng)(1)單一菌絲類型一級菌種接種無菌操作要點a在無菌箱內(nèi)，將待接的斜面試管(無冷凝水)、購來或自行培養(yǎng)好的一級原始種，酒精燈、火柴盒、接種針等放入接菌箱內(nèi)。下一頁單一菌絲類型一級菌種接種無菌操作要點b按接種箱操作規(guī)程進行消毒。c打開工作燈，用75%的酒精棉球擦雙手，伸入接種箱內(nèi)，再擦接種工具。d點燃酒精燈。5右手持接種針，將頂端燒紅，并將整支接種針過火幾次。6用左手手指和手掌托持兩支試管，食指與中指與中指夾持一級原始種，無名指和小指夾持空白斜面培養(yǎng)基試管。用右手無名指和小指夾持原始種棉塞，小指和魚際夾持空白試管棉塞。火焰封口雙管。下一頁單一菌絲類型一級菌種接種無菌操作要點7將接種針靠在試管內(nèi)壁冷卻，然后挑取一小塊基內(nèi)菌絲瓊脂塊，迅速移接到空白斜面中央。棉塞燎考至微焦，塞回試管口上。右手用接種針伸入管內(nèi)挑，持住原始一級種試管，保持火焰封口狀態(tài)，左手將接好的試管放下，重新取一空白試管，重復上述操作，直至一級菌種用完為止。下一頁(2)注意事項

接種過程中，注意保持試管與桌面接近平行，試管口略向下傾斜，不要遠離酒精燈火焰。周而復始。一支一級菌種可擴展幾十支試管。氣生菌絲旺盛的菌類，如蘑菇、茯苓、，應將氣生菌絲掉，用基內(nèi)菌絲移接。不同菌類移接用的接種塊大小與轉管培養(yǎng)后菌種商品外觀和質(zhì)量有關。一般蘑菇、一級菌種轉管時，接種塊越小越好，這樣移接后氣生型菌絲不易倒伏。下一頁2混合型菌絲一級種的擴大培養(yǎng)

銀耳純白菌絲生長緩慢。為了單獨獲得銀耳純菌絲和為了提純羽毛狀菌絲，常在耳木分離時將兩種菌絲分別分離出，并分開擴接。使用時從純白團四周暈圈處鉤取小米粒大小帶培養(yǎng)基的菌絲體移入新培養(yǎng)基內(nèi)，24℃培養(yǎng)一周后，再在離銀耳純白菌絲團外沿2cm處接入一小點羽毛狀菌絲，再繼續(xù)培養(yǎng)一周左右，就可以擴接二級菌種。下一頁(二)二級菌種的擴大培養(yǎng)1.單一菌絲類型二級菌種的擴大培養(yǎng)將滅菌好的二級菌種培養(yǎng)瓶數(shù)十瓶(視接種箱的大小)連同接種工具、一級菌種放入接菌箱內(nèi)，按常規(guī)進行熏蒸消毒。按無菌操作要求，在接種箱內(nèi)將接種針進行火焰滅菌、冷卻。將一級菌塊劃成1㎝大小的接種塊，用接種鉤鉤住，彎鉤朝上，左手持二級菌種瓶橫放，用右手小指和魚際抓住棉塞，左手將二級種瓶反時針旋轉后退，撥脫棉塞，火焰封口。下一頁二級菌種的擴大培養(yǎng)將已鉤取的菌種塊抖入二級菌種瓶，塞上棉塞。經(jīng)搖二級菌種瓶，使菌種塊滾至培養(yǎng)基面中央。按此法每支試管可接二級菌種瓶8～10瓶。操作時注意：不能將二級種瓶口朝上，同時注意撥出棉塞后，不能碰到其它器具及接種箱壁。若接種塊掉在箱底上，應棄之不用。每接完一支一級種，接種工具應重新火焰滅菌。待整箱二級菌種瓶全部接完后，開啟箱蓋。下一頁2.混合型二級菌種的擴大培養(yǎng)混合型原種的接種和單一型二級種接種的方法大同小異。顯著不同的是：銀耳一級種培養(yǎng)基的前后端應棄之不用，僅要繡球狀銀耳純白菌絲及附近長有黑灰色羽毛狀菌絲的菌塊。按上述方法，連同培養(yǎng)基整塊鉤取出，移入菌種瓶內(nèi)，每支試管僅能接一瓶二級菌種，不能貪多。接完二級菌種，用手拍打，振動瓶，使一級菌種塊純白菌絲面朝上，千萬不能朝下，否則報廢。

下一頁混合型二級菌種的擴大培養(yǎng)培養(yǎng)溫度初期27～28℃，促使羽毛狀菌絲蔓延，5～6天之后馬上降至22～23℃，這是純白菌絲生長適宜的溫度。接種后培養(yǎng)20～25天，接種塊逐漸形成膠質(zhì)化的原基團，并吐出水珠，適合作為段木銀耳種，菌齡控制在40～45天。若在同樣的溫度下，12～13天膠化，并逐漸開片，吐黃水，則適合作為代料棒栽銀耳種，菌齡控制在15～18天內(nèi)使用。

下一頁(三)三級種擴大培養(yǎng)三級種是用培養(yǎng)好的二級種進行擴大培養(yǎng)。1單一菌絲型三級種的接種待接栽培瓶橫放入接種箱左邊，選無污染的二級菌種瓶置于接種架上，同時將一團浸有95%酒精的棉花團，長柄攝子、接種匙、接種架酒精燈、火柴等一起放入接種箱內(nèi)，按常規(guī)方消毒。接種時用長柄攝子夾緊酒精棉花團，打開二級種瓶的棉花塞，將棉花團點燃，在瓶口附近燃燒，進行瓶口消毒，然后置于接種架上火焰封口。下一頁三級種擴大培養(yǎng)然后接種匙火焰滅菌后將二級種表面的培養(yǎng)基扒掉，再將下面長滿菌絲的培養(yǎng)基在瓶內(nèi)挖碎。接種匙插放在二級菌種瓶內(nèi)，置于接種架上，左手持三級種瓶，右手小指及手掌魚際夾住棉塞旋轉打開，靠近二級種瓶口，然后用接種匙鏟取一滿匙，移入三級種瓶內(nèi)，再塞緊棉塞，接種完畢，豎放在接種箱右邊。周而復始。接種完畢取出，貼上標簽，輕振使一部分二級菌種塊落入種穴，一部分布滿表面。排入培養(yǎng)室。每瓶二級菌種可接25～30瓶三級種。下一頁2.混合型三級種的擴大培養(yǎng)將待接三級種瓶及接種匙等工具放入接種箱內(nèi)，進行常規(guī)消毒，其操作過程和上述單一菌絲型三級種擴接一樣，最的不同點是：用接種匙將瓶內(nèi)銀耳原基鏟平，挖出子實體原基，棄之，將子實體下面2～3cm內(nèi)較結實的菌絲塊，用接種匙搗碎。然后挖取耳基周圍幾匙的木屑，搗碎，兩者混合均勻。下一頁混合型三級種的擴大培養(yǎng)接種匙鏟接量只需蠶豆大小，移入三級種瓶內(nèi)，每瓶二級菌種可接3～4瓶三級種，其余棄之不用。因銀耳是混合型的，純白菌絲僅生長在表面淺層培養(yǎng)基內(nèi)，又由于羽毛狀菌絲繁殖十分迅速，所以銀耳培養(yǎng)基裝料只需裝1/4瓶即可。移接中注意防止燙傷菌絲。返回二、貼標簽一級種試管標簽應貼在前端，既不能遮住棉塞，又不遮住培養(yǎng)基斜面的部位，以免在檢查棉塞和斜面是否污染時千萬不便；二級、三級種標簽多貼在瓶上部側壁；塑料袋難貼標簽，可將標簽貼在塑料套環(huán)上。出可用記號筆將標簽內(nèi)容寫在塑料袋外。標簽內(nèi)容注明菌種名稱、菌株號、接種者或單位接種日期四項。菌種名可用中文注明，也常用拉丁文學名的縮寫注明。習慣上常用的縮寫字母。

下一頁貼標簽菌種名多寫在標簽的第一行，字體較大。菌株號是某一菌種特定菌株代號，更多的是用有一定代表意義的數(shù)字表示，它一般要求用較小號的字符寫在菌種之后。購買一級菌種代號不宜自行更改。接種者或單位是注明該菌種制作責任人。接種日期菌種使用時作為推算菌齡的依據(jù)?？蒲猩希N上的標簽一般較復雜，內(nèi)容較多，除上述內(nèi)容外，還要注明分離方法如孢子分離(S)、組織分離(T)、基內(nèi)菌絲分離(M)等。返回菌種培養(yǎng)培養(yǎng)室內(nèi)溫度、濕度、光照、空氣等條件彼此聯(lián)系，互相影響。1.溫度控制培養(yǎng)室內(nèi)溫度應根據(jù)季節(jié)變化進行控制，并結合培養(yǎng)階段確定培養(yǎng)溫度。(1)冬季保溫、夏季降溫冬季氣溫低，菌種培養(yǎng)室要有保溫措施，使培養(yǎng)室溫度保持在25℃左右，不保溫浪費然。夏季菌種呼吸產(chǎn)生熱量，使培養(yǎng)室溫度升高，可