流式細(xì)胞術(shù)分選嗜堿性粒細(xì)胞的研究

流式細(xì)胞術(shù)分選嗜堿性粒細(xì)胞的研究

近年來的結(jié)果表明，嗜堿顆粒在過敏反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，是過敏炎癥的作者和傳播者。嗜堿性粒細(xì)胞占外周血白細(xì)胞的小部分(<1%),提純一定數(shù)量的嗜堿性粒細(xì)胞就需要較多的血,這限制了對它的深入研究。臍帶血的血量較多,可得到50～150mL的量,并且臍帶靜脈血相當(dāng)于新生兒血。本文采用流式細(xì)胞術(shù)分選提純產(chǎn)婦臍帶血嗜堿性粒細(xì)胞,以期得到研究過敏性疾病發(fā)病機(jī)制的理想標(biāo)本。1材料和方法1.1資產(chǎn)采集,采集帶血新生兒娩出后,用血管鉗鉗夾離嬰兒端約3cm處的臍帶,將針頭插入臍靜脈,抽取臍帶血,于產(chǎn)后10min內(nèi)采集完畢。共收集足月產(chǎn)婦臍帶血6份。1.2細(xì)胞數(shù)據(jù)的提取臍血每10mL加1mL0.1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑抗凝,按5∶1的比例加入6%葡聚糖,混勻,37℃水浴30min,沉淀紅細(xì)胞,吸出含豐富白細(xì)胞的上清液,離心,用含10mmol/LEDTA、pH值為7.2的0.01mmol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次,懸浮細(xì)胞。1.3胺及含融資日白的制備試管中依次加入1.065g/mLFicoll-泛影葡胺及上述白細(xì)胞混懸液各4mL,4℃離心30min。離心后吸出上層細(xì)胞,用含10mmol/LEDTA、pH值為7.2的0.01mmol/L的PBS洗2次。1.4fcr熒光微球檢測細(xì)胞形態(tài)密度梯度離心所得的細(xì)胞加入PBS、EDTA和0.5%BSA,在4℃的環(huán)境中放置20min。每1×107個細(xì)胞中加入80μLPBS、EDTA和牛血清白蛋白試劑(BSA),20μLFc受體阻斷試劑(FcRBlockingResgent),10μLCD203c-PE和10mLCD45-PerCP免疫熒光抗體標(biāo)記20min。分離前用Flow-Check熒光微球校準(zhǔn)儀器,標(biāo)本上機(jī)后,以前向角散射光(forwardscatter,FSC)和側(cè)向角散射光(sidescatter,SSC)參數(shù)觀察細(xì)胞形態(tài),選取SSC低信號細(xì)胞。CD203c-PE+、CD45-PerCPint的細(xì)胞即為嗜堿性粒細(xì)胞。1.5愛酸性粒細(xì)胞染色的計算細(xì)胞經(jīng)阿利新藍(lán)染色并計數(shù),統(tǒng)計其純度及回收率。細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色,觀察其活性。2嗜堿性細(xì)胞純度臍帶血葡聚糖沉淀紅細(xì)胞后嗜堿性粒細(xì)胞純度為(0.26±0.17)%,細(xì)胞回收率為(90.08±1.04)%。經(jīng)Ficoll-泛影葡胺分離后嗜堿性粒細(xì)胞純度為(2.97±0.36)%,細(xì)胞回收率為(75.43±1.99)%。流式細(xì)胞術(shù)分選后嗜堿性粒細(xì)胞純度為(95.02±2.94)%,回收率為(61.42±5.95)%。見表1。臺盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞活性為(99.24±0.57)%。3因子分析方法步驟由于嗜堿性粒細(xì)胞在血中所占比例低,且缺乏令人滿意的純化方法,故在很大程度上束縛了對它的深入研究。許多研究都利用細(xì)胞株KU812,它最先是從慢性髓性白血病患者中獲取并建立起來的。KU812是一種未成熟的嗜堿性粒細(xì)胞前體,被作為嗜堿性粒細(xì)胞分化的模型。有研究表明,IgE并不能誘導(dǎo)KU812的細(xì)胞內(nèi)信號發(fā)生,如酪氨酸磷酸化和鈣離子釋放。Aumüller等發(fā)現(xiàn),嗜堿性粒細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素(IL)-4的活性在很大程度上受儲存條件的影響,因為它與人原始嗜堿性粒細(xì)胞的形態(tài)和功能有根本的區(qū)別,故細(xì)胞株KU812不適用于過敏反應(yīng)啟動機(jī)制的研究。臍帶血中的免疫細(xì)胞尚未直接受到外界過敏原的刺激,是研究過敏反應(yīng)啟動機(jī)制的較好材料。臍帶血成分較外周血復(fù)雜,有未成熟的細(xì)胞,其表面標(biāo)志可能不同于成熟細(xì)胞,所以臍帶血細(xì)胞的純化方法可能不同于外周血。采用磁珠負(fù)性選擇和密度梯度離心相結(jié)合的純化方法,從外周血可以得到高純度的嗜堿性粒細(xì)胞。國外資料顯示,嗜堿性粒細(xì)胞的純度為(97.60±3.96)%,回收率為(49.7±15.6%)。此外還有去除紅細(xì)胞后用磁珠負(fù)選法,Gibbs等得到的嗜堿性粒細(xì)胞純度為(99.34±0.88)%,回收率為75.6%。但這些方法對臍帶血中嗜堿性粒細(xì)胞的純化效果沒有外周血理想,因為臍帶血成分不同于外周血,有較多的未成熟的細(xì)胞,負(fù)性選擇可能得到不少雜細(xì)胞。在分離嗜堿性粒細(xì)胞的試劑盒中有人類白細(xì)胞抗原(HLA)-DR基因分型試劑(HLA-DR)抗體,外周血嗜堿性粒細(xì)胞HLA-DR是陰性的;而臍帶血有未成熟的嗜堿性粒細(xì)胞,其HLA-DR是陽性的,約占總嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)的59%,采用此方法將丟失這部分細(xì)胞,降低回收率。我們曾用抗凝臍血30～50mL,先以6%葡聚糖沉淀紅細(xì)胞,獲取白細(xì)胞,進(jìn)而用Ficol1-Hypaque作密度梯度離心獲得3層細(xì)胞,上層即為初步純化的嗜堿性粒細(xì)胞,最后采用結(jié)合CD2+、CD14+、CD16+和CD19+單抗的免疫磁珠,通過陰性選擇方式純化嗜堿性粒細(xì)胞,其平均純度為75.8%,回收率為81.5%。Reimer等用IL-3刺激培養(yǎng)臍帶血21d,誘導(dǎo)未成熟嗜堿性粒細(xì)胞成熟,再通過兩步法磁珠負(fù)選,得到臍帶血嗜堿性粒細(xì)胞的純度為(95.0±0.5)%,回收率為(59.0±1.5)%,但操作耗時復(fù)雜。這就期望建立簡便的方法來獲得臍帶血中高純度、高回收率的嗜堿性粒細(xì)胞。有學(xué)者曾用流式細(xì)胞術(shù)選取CD123+HLA-DR-的細(xì)胞即為嗜堿性粒細(xì)胞,但這也是用于外周血。而在臍帶血中有未成熟的嗜堿性粒細(xì)胞,使用此方法將丟失這部分HLA-DR+細(xì)胞,回收率降低約35%。還有作者提出先用磁珠分選去除其他細(xì)胞,提高嗜堿性粒細(xì)胞的比例后,再用流式細(xì)胞術(shù)分選。理論上結(jié)合了兩種分選法可以得到更好的結(jié)果,Willheim等取350～450mL外周血用1.077Ficoll-Pague初分后,采用免疫磁珠負(fù)選法去除CD14+的細(xì)胞,再用流式細(xì)胞術(shù)分選CDw17+CD14-的細(xì)胞即為嗜堿性粒細(xì)胞,純度為(99.5±0.4)%,但回收率僅為8%～25%。近期文獻(xiàn)未見結(jié)合兩種方法來純化嗜堿性粒細(xì)胞的報道,這可能是去除了絕大多數(shù)的陰性細(xì)胞,反而在用流式細(xì)胞術(shù)分選時缺乏參照而難以定位。CD203c是新近發(fā)現(xiàn)的嗜堿性粒細(xì)胞的表面標(biāo)志,它也可表達(dá)在未成熟嗜堿性粒細(xì)胞、未成熟和成熟的肥大細(xì)胞表面。臍帶血中可能會存在肥大細(xì)胞,而肥大細(xì)胞因與嗜堿性粒細(xì)胞的生理功能相似,故需要去除,以免影響實驗結(jié)果。由于肥大細(xì)胞不表達(dá)CD45,因此分選CD203c-PE+、CD45-PerCPint的細(xì)胞即為嗜堿性粒細(xì)胞。國內(nèi)外至今尚未見以此法純化臍帶血中嗜堿性粒細(xì)胞