聚谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)

課程設(shè)計(jì)說(shuō)明書不同分子量聚谷氨酸制備條件研究學(xué)院（系） 年級(jí)專業(yè)： 學(xué)號(hào): 學(xué)生姓名：指導(dǎo)教師： 教師職稱： 2013-2014春季學(xué)期生物工程專業(yè)課程設(shè)計(jì)結(jié)題論文不同分子量聚谷氨酸制備條件研究學(xué)院（系）： 年級(jí)專業(yè)： 學(xué)號(hào): 學(xué)生姓名： 指導(dǎo)教師： 教師職稱： 摘要Y-PGA是一種有極大開(kāi)發(fā)價(jià)值和前景的多功能性生物制品，近年來(lái)被作為增稠劑，保濕劑，藥物載體等而一直被廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域。它是一種水溶性和可生物降解的新型生物高分子材料，可通過(guò)微生物合成。在生產(chǎn)低聚谷氨酸工藝當(dāng)中，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)聚谷氨酸具有很好的前景，但在利用微生物發(fā)酵法制備產(chǎn)物時(shí)，生產(chǎn)的聚谷氨酸具有較大的分子量，需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的降解處理。本設(shè)計(jì)擬對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)的高分子量的聚谷氨酸進(jìn)行降解，并優(yōu)化其降解條件，從而得到不同分子量的低聚谷氨酸分子，并利用瓊脂糖凝膠電泳和高效液相凝膠色譜檢測(cè)其降解后的分子量，從而確定最佳降解條件。本設(shè)計(jì)主要分為三個(gè)部分對(duì)不同分子量的Y-PGA的制備情況進(jìn)行了研究。第一部分是通過(guò)微生物發(fā)酵，提取得到80-100萬(wàn)分子量的大分子聚谷氨酸產(chǎn)物的設(shè)計(jì)；第二部分根據(jù)聚谷氨酸分子特性，設(shè)計(jì)篩選可降解大分子聚谷氨酸的方法，并優(yōu)化降解條件，得到不同分子量的低聚谷氨酸分子，并找到合適的方法進(jìn)行分離純化；第三部分是在前兩部分的基礎(chǔ)上，通過(guò)建立瓊脂糖凝膠電泳和液相凝膠色譜檢測(cè)不同分子量低聚谷氨酸的方法，從而設(shè)計(jì)出最佳的制備條件。關(guān)鍵詞：生物發(fā)酵法、聚谷氨酸、降解條件、檢測(cè)方法目錄TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"第一部分文獻(xiàn)綜述 3\o"CurrentDocument"Y-聚谷氨酸簡(jiǎn)介 3\o"CurrentDocument"1.2聚谷氨酸結(jié)構(gòu) 41.3聚谷氨酸性質(zhì)： 41.3.1吸水特性 4生物可降解性 4y-PGA的水解特性 5\o"CurrentDocument"y-PGA的應(yīng)用前景 5\o"CurrentDocument"y-PGA的應(yīng)用 52.1.1聚y-PGA是一種微生物絮凝劑 5y-PGA作為一種新型的高分子吸水性材料 5y-PGA作為新型的藥物載體 6\o"CurrentDocument"y-PGA合成方法 7\o"CurrentDocument"3.1化學(xué)法合成 73.1.1傳統(tǒng)的肽合成法 73.1.2二聚體縮聚法 7\o"CurrentDocument"3.2提取法合成 7\o"CurrentDocument"3.3微生物生物合成法 7\o"CurrentDocument"3.3.1代謝途徑 7\o"CurrentDocument"研究進(jìn)展 8\o"CurrentDocument"總結(jié)——本設(shè)計(jì)的前景分析以及研究意義 8\o"CurrentDocument"5.1前景分析 8\o"CurrentDocument"5.2研究意義 9\o"CurrentDocument"第二部分課程設(shè)計(jì)部分 101?材料 10\o"CurrentDocument"1.1實(shí)驗(yàn)原料和試劑 101.2實(shí)驗(yàn)器材 112.方法 112.1微生物培養(yǎng)方法 11平板培養(yǎng) 11\o"CurrentDocument"種子培養(yǎng) 11\o"CurrentDocument"搖瓶發(fā)酵 11\o"CurrentDocument"2.2YGA的純化方法 12菌體的分離 12\o"CurrentDocument"乙醇沉淀 122.2.3丙酮分級(jí)沉淀 122.2.4透析袋透析除鹽 122.2.5硅膠薄層層析 錯(cuò)誤!未定義書簽。\o"CurrentDocument"2.3生理指標(biāo)的測(cè)定方法 12生物量測(cè)定 錯(cuò)誤!未定義書簽。細(xì)胞數(shù)測(cè)定 錯(cuò)誤!未定義書簽。分子量分析 12粘度的測(cè)定 13\o"CurrentDocument"pH穩(wěn)定性的測(cè)定 132.4碳源試驗(yàn) 錯(cuò)誤!未定義書簽。2.5氮源試驗(yàn) 錯(cuò)誤!未定義書簽。2.6前體物質(zhì)L-谷氨酸試驗(yàn) 錯(cuò)誤!未定義書簽。2.7碳源、氨源、前體物質(zhì)正交試驗(yàn) 錯(cuò)誤!未定義書簽。2.8無(wú)機(jī)離子正交試驗(yàn) 錯(cuò)誤!未定義書簽。TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 133.1培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計(jì) 14培養(yǎng)基中不同碳源對(duì)聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計(jì) 14培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計(jì) 14培養(yǎng)基中前體谷氨酸對(duì)聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計(jì) 143.2培養(yǎng)基中碳源、氨源、前體物質(zhì)正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì) 143.3不同pH對(duì)不同分子量聚谷氨酸影響的設(shè)計(jì)分析?錯(cuò)誤!未定義書簽。\o"CurrentDocument"4.設(shè)計(jì)分析 154.1培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計(jì)??…錯(cuò)誤!未定義書簽。4.1.1碳源對(duì)產(chǎn)物r-PGA分子量合成的影響的設(shè)計(jì)分析錯(cuò)誤！未定義書簽。培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計(jì)分析錯(cuò)誤!未定義書簽。培養(yǎng)基中前體谷氨酸對(duì)聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計(jì)錯(cuò)誤!未定義書簽。4.2培養(yǎng)基中碳源、氨源、前體物質(zhì)正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)??錯(cuò)誤!未定義書簽。4.3不同pH對(duì)不同分子量聚谷氨酸影響的設(shè)計(jì)分析?錯(cuò)誤!未定義書簽。5總結(jié)體會(huì) 15參考文獻(xiàn) 16第一部分文獻(xiàn)綜述1.概況背景1.1Y-聚谷氨酸簡(jiǎn)介Y-聚谷氨酸(Y-PGA)是一種由微生物生物合成的聚谷氨酸，它由D-谷氨酸單體或L-谷氨酸單體以羧基和氨基相縮合而成⑴。在生物體內(nèi)y-PGA生物相容性良好，可以降解為谷氨酸而直接被生物體吸收，對(duì)于用作生物醫(yī)用材料有明顯優(yōu)點(diǎn)。另外，主鏈上有大量游離羧基存在，使y-pga具有水溶性聚羧酸的性質(zhì)，如強(qiáng)吸水和保濕性能，可用于化妝品、食品、分散劑、螯合劑、建筑涂料、防塵等領(lǐng)域23］。這些活性位點(diǎn)為材料的功能化提供了條件。由于其良好的環(huán)境友好性，在注重環(huán)保強(qiáng)調(diào)可持續(xù)發(fā)展的今天，這種來(lái)自生物的可降解型功能材料受到人們的青睞。1.2聚谷氨酸結(jié)構(gòu)對(duì)Y-PGA的氨基酸組分分析表明，該物質(zhì)只有谷氮酸一種氨基酸組成，其純化樣品在216nm處有吸收峰，與典型蛋白質(zhì)吸收峰不同。丫-PGA經(jīng)硅膠層析后，用不同官能團(tuán)顯色劑處理，a—萘酚、間苯二酚、甲基苯二酚反應(yīng)呈陰性，雙縮脲反應(yīng)陰性而茚三酮反應(yīng)陽(yáng)性，該物質(zhì)沒(méi)有典型的肽鏈結(jié)構(gòu)，也不是一種環(huán)狀多肽。隨著溫度的提高，y-pga水溶液在一定的溫度范圍內(nèi)粘度變化不大，聚合物結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。在高溫下，粘度下降快.y-pga水解也很快，分子量逐漸變小，y-pga的水解是由鏈的隨機(jī)切割引起的。不同生產(chǎn)方式得到的y-pga的分子量有差異，如采用地衣芽抱桿菌搖瓶發(fā)酵得到的Y-PGA的分子量為1.06x105Da，而通過(guò)5L發(fā)酵罐生產(chǎn)的丫-PGA的分子量為2.47x105Da。丫-PGA的等電點(diǎn)為3.47，它是一種酸性氮基酸聚合物。1.3聚谷氨酸性質(zhì)：1.3.1吸水特性由于y-pga極易溶于水，因此其具有很好的吸水特性，王傳海等對(duì)y-pga的吸水性能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，y-pga的最大自然吸水倍數(shù)可達(dá)到1108倍，比目前市售的聚丙烯酸鹽類吸水樹脂高1倍以上，對(duì)土壤水分的吸收倍數(shù)為30-80倍。y-PGA的水浸液在土壤中具有一定的保水力和較理想的釋放效果，有明顯的抗旱促苗效應(yīng)。在0.206mol/L濃度的PEG(6000)模擬滲透脅迫條件下，y-pga仍有較強(qiáng)的吸水和保水能力，可明顯提高小麥和黑麥草的發(fā)芽率，用其直接拌種也能顯著提高種子的發(fā)芽率⑸。y-pga的吸水性和保水性可使y-pga被廣泛應(yīng)用于干旱地區(qū)保水以及沙漠綠化。生物可降解性生物可降解性是y-pga的特性之一。所有y-pga產(chǎn)生菌株都可以以y-pga作為營(yíng)養(yǎng)源進(jìn)行生長(zhǎng)。在培養(yǎng)液中存在一種與y-pga降解有關(guān)的解聚酶。其它自然菌株也具有降解y-pga的能力。以y-pga作為唯一碳源和氮源對(duì)可降解r-PGA的菌株進(jìn)行篩選，結(jié)果篩選出至少12株可降解r-PGA的菌株⑹。由此可知，發(fā)酵生產(chǎn)y-pga的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)量有較大的影響，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致y-pga分子被酶解而損失。r-PGA的水解特性r-PGA的水溶液在10mL、濃度為6mol/L的HC1中，抽真空封口，105°C的烘箱的條件下可以水解為谷氨酸，呂瑩等m的研究表明，水解17h、25h、48h的結(jié)果一致。此特性可用于r-PGA純度的測(cè)定。2?-pGA的應(yīng)用前景y-PGA的應(yīng)用r-PGA是一種天然存在的水溶性的聚合氨基酸，具有生物可降解性，可食用且對(duì)人體和環(huán)境無(wú)毒害。近年來(lái)其被作為生物絮凝劑，增稠劑，加濕劑，藥物載體，藥物緩釋劑，生物可降解纖維，高吸水性樹脂，重金屬吸收劑以及食品添加劑等一直被廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域如食品工業(yè)，藥物工業(yè)，化妝品工業(yè)及污水處理中，是一種有極大開(kāi)發(fā)價(jià)值和前景的多功能新型生物制品。2.1.1聚r-PGA是一種微生物絮凝劑r-PGA可以用作飲用水、廢水、發(fā)酵食品工業(yè)下游過(guò)程溶液的生物絮凝劑以及重金屬或放射性物質(zhì)螯合劑，用于回收金屬盒減少環(huán)境污染等。y-PGA作為一種新型的高分子吸水性材料近年來(lái)，人們把水溶性高分子作為精細(xì)化工的骨干產(chǎn)品之一，越來(lái)越受到人們的重視。它的應(yīng)用范圍幾乎涉及人所能涉及的任何領(lǐng)域。隨著高分子材料的快速發(fā)展，在其重要性日益突現(xiàn)的同時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)了它的不足之處，即大部分的人工合成的高分子材料在自然界難以降解。在人們?cè)絹?lái)越關(guān)心自己生存環(huán)境的今天，不可降解的高分子材料造成的“白色污染”（如聚乙烯、聚丙烯等），也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。為了解決這個(gè)問(wèn)題，人們開(kāi)展了各種研究工作。制成了各種可生物降解材料［8］。在日本，聚谷氨酸得到廣泛應(yīng)用，主要以谷氨酸Y-甲基酯為基礎(chǔ)，生產(chǎn)新型聚合物IITC。此類聚合物可以用來(lái)制造皮革、纖維、食品包裝膜等。聚合D-谷氨酸用苯乙烯改性后，可得到高抗堿性的纖維樹脂。若通過(guò)改性再聚合，可得到比一般天然纖維和化學(xué)纖維更優(yōu)的材料，如外科手術(shù)的縫合線，就是以氨基酸和羧酸為基礎(chǔ)，由易水解纖維狀和薄膜狀的聚合物制得的。而滲透殺菌劑、防腐劑、抗生素的聚合氫基酸對(duì)傷口和皮膚病還有防治作用。以谷氨酸和烷基谷氨酸酯的共聚物為基礎(chǔ)，研制出來(lái)的聚合物是藥品很好的包裹材料，可作膠囊或糖衣片。日本九州大學(xué)原敏夫等人通過(guò)大豆發(fā)酵，提取y-PGA，用電子柬照射，制成y-PGA樹脂，這種物質(zhì)呈白色粉末狀，具有極強(qiáng)的吸水性，其吸水性能是紙和尿不濕的5倍。y-PGA吸水飽和后，呈凝膠狀，可包裹在植物種子的表面上作為種子的理想包衣材料。原敏夫認(rèn)為，這種樹脂是沙漠綠化的好武器，并提出了中國(guó)綠化沙漠的設(shè)想（原敏夫特開(kāi)平）。另外，y-PGA作為一種凝膠材料，也可以起分子篩作用［9］。y-PGA作為新型的藥物載體y-PGA具有良好的生物親和性和生物降解性，作為藥物載體可提供藥物緩釋性、靶向性，提高藥物水溶性，降低藥物不良反應(yīng)，從而提高藥物療效。（1）用作金屬螫合物抗癌藥物順二氯二氨鉑（CDDP）的載體該藥物為重金屬絡(luò)合物，微溶于水，且在水中不穩(wěn)定，療效低，對(duì)細(xì)胞毒性大，用y-PGA（相對(duì)分子量4x104）作為藥物載體，可形成有活性的、相對(duì)穩(wěn)定的CDDP-PGA復(fù)合物，該復(fù)臺(tái)物有較高的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性和對(duì)正常細(xì)胞較低的毒性，有利于Pt2+對(duì)配體的親和，而且其治療劑量范圍寬。（2）作為水不溶性植物類化療藥物的載體化療藥物大多難溶或不溶于水，細(xì)胞毒性大，選擇性小。如喜樹堿難溶于水，而且它的內(nèi)酯形式不穩(wěn)定，導(dǎo)致使用受限制，療效低。但10-羥CPT或9-氨基CPT與PGA偶聯(lián)形成CPT-PGA復(fù)合物后，水溶性大為增加。復(fù)合物對(duì)同源的和異源的腫瘤都保持較高的抗腫瘤活性。（3）用作抗生素類抗癌藥物阿霉素的載體，可明顯地提高療效。（4） y-PGA的半乳糖或甘露糖酯化衍生物可作為肝細(xì)胞特殊藥物的載體，通過(guò)糖酯化的PGA的結(jié)合作用把相對(duì)分子量低的藥物運(yùn)送到肝細(xì)胞中，起到了靶向作用。（5） y-PGA與明膠有較好的兼容性，適合制作外科及手術(shù)用的可生物降解的粘膠劑、止血?jiǎng)┘懊芊鈩?0］。3.YGA合成方法化學(xué)法合成傳統(tǒng)的肽合成法傳統(tǒng)的肽合成法是將氨基酸逐個(gè)連接形成多肽，這個(gè)過(guò)程一般包括基團(tuán)保護(hù)、反應(yīng)物活化、偶聯(lián)和脫保護(hù)?；瘜W(xué)合成法是肽類合成的重要方法，但合成路線長(zhǎng)、副產(chǎn)物多、收率低，尤其是含20個(gè)氨基酸以上的純多肽合成［11］。二聚體縮聚法由L-Glu、D-Glu及消旋體（D,L-Glu）反應(yīng)生成a-甲基谷氨酸，后者凝聚成谷氨酸二聚體后，再與濃縮劑1，3-二甲氨丙基-3-乙基碳亞二胺鹽酸鹽及1-羥苯基三吡咯水合物在N,N-二甲基甲酰胺中發(fā)生凝聚，獲得產(chǎn)率為44%~91%、相對(duì)分子質(zhì)量為5000~20000的聚谷氨酸甲基酯，經(jīng)堿性水解變成y-pga?；瘜W(xué)合成法難度很大，沒(méi)有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。提取法合成早期，日本生產(chǎn)y-pga大多采用提取法，用乙醇將納豆（一種日本的傳統(tǒng)食品）中的y-PGA分離提取出來(lái)。由于納豆中所含的y-PGA濃度甚微，且有波動(dòng)，因此提取工藝十分復(fù)雜，生產(chǎn)成本甚高，同樣難以大規(guī)模生產(chǎn)。微生物生物合成法迄今為止的發(fā)酵生產(chǎn)仍處于試驗(yàn)室階段，小試生產(chǎn)方法歸納起來(lái)主要有分批發(fā)酵法、連續(xù)發(fā)酵法、液體兩相發(fā)酵法、攪拌罐反應(yīng)器自循環(huán)發(fā)酵法、固體發(fā)酵法和固定化酶法等6種，分批發(fā)酵法簡(jiǎn)單方便，容易操作和控制，因此在實(shí)驗(yàn)室研究中用的較為廣泛。3.3.1代謝途徑自從1942年Bovarnick等發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬微生物能在培養(yǎng)基中蓄積Y-PGA以來(lái)，利用微生物生物聚合生成Y-PGA的研究十分活躍。人們對(duì)不同的微生物進(jìn)行了代謝途徑分析，由于分析手段和其他人為原因的限制，以致現(xiàn)在y-PGA的代謝途徑仍然是一個(gè)黑箱模型。4.研究進(jìn)展由于y-pga具有環(huán)境友好等特性使其應(yīng)用日益廣泛，對(duì)其研究越來(lái)越多，然而目前國(guó)內(nèi)主要是對(duì)y-pga生產(chǎn)方面尤其是菌種及發(fā)酵條件的研究，而且大多數(shù)發(fā)酵生產(chǎn)仍處于試驗(yàn)室階段，實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化還有一定距離。國(guó)外對(duì)其應(yīng)用研究則比較多，尤其是在附加值比較高的醫(yī)藥領(lǐng)域。在今后研究中，一方面是在提高y-PGA產(chǎn)量同時(shí)建立一種生產(chǎn)成本低廉、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)條件溫和的工藝，為大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)：另一方面是不斷擴(kuò)大應(yīng)用研究的廣度和深度，同時(shí)進(jìn)行創(chuàng)新性研究［12］。5.總結(jié)——本設(shè)計(jì)的前景分析以及研究意義前景分析近年國(guó)內(nèi)強(qiáng)大的需求釋放與巨大的產(chǎn)能缺口，是化工新材料被廣泛看好的最重要的理由。新材料技術(shù)是21世紀(jì)三大關(guān)鍵技術(shù)之一，是發(fā)展信息、航天、能源、生物等高新技術(shù)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)已成為全球經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的源動(dòng)力和各國(guó)提升核心競(jìng)爭(zhēng)力的焦點(diǎn)。包括新的功能聚合物、復(fù)合材料、高性能化的通用塑料新品種、可降解塑料、納米材料等。與傳統(tǒng)化工材料相比。它們具有優(yōu)異性能或特殊功能．對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)特別是高技術(shù)領(lǐng)域及尖端技術(shù)有重要作用。長(zhǎng)期以來(lái)，新材料產(chǎn)品及其原料對(duì)外依存度較高，一些高端品種甚至完全依賴進(jìn)口。而近年來(lái)．國(guó)內(nèi)龍頭企業(yè)通過(guò)不斷研發(fā)和創(chuàng)新，形成了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的工藝和技術(shù)，逐漸具有成本和規(guī)模優(yōu)勢(shì)，替代進(jìn)口前景廣闊。我國(guó)政府對(duì)新材料行業(yè)在各個(gè)層次上都有扶持性政策。在前瞻性研究方面，國(guó)家計(jì)劃每年對(duì)新材料項(xiàng)目援助在3.5億元左右：在產(chǎn)業(yè)項(xiàng)目方面，有火炬計(jì)劃、中小企業(yè)創(chuàng)新基金、國(guó)家科技攻關(guān)計(jì)劃等每年通過(guò)撥款和貼息貸款等形式給予資助；按照國(guó)家政策的精神．各地各級(jí)政府也都給予新材料企業(yè)出口補(bǔ)貼和稅收優(yōu)惠。這些政策的實(shí)施使中國(guó)新材料科技水平大大提高．同時(shí)引導(dǎo)大量的社會(huì)資金向新材料領(lǐng)域投資，促進(jìn)了新材料科技成果轉(zhuǎn)化，推動(dòng)了新材料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。市場(chǎng)發(fā)展需要和國(guó)家政策導(dǎo)向都使得綠色生物環(huán)保材料企業(yè)的投資風(fēng)險(xiǎn)降到比較低的水平［13］。我國(guó)氨基酸行業(yè)的主要競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手是日本，多年來(lái)與日本既競(jìng)爭(zhēng)又合作。前些年，在我國(guó)不能生產(chǎn)原料時(shí)，對(duì)方輸入原料，同時(shí)輸入生產(chǎn)技術(shù)?，F(xiàn)在我們可以生產(chǎn)氨基酸原料，對(duì)方則進(jìn)行精加工。所以國(guó)內(nèi)企業(yè)在產(chǎn)品精加工方面應(yīng)該重視，不應(yīng)僅停留在生產(chǎn)粗原料上。國(guó)內(nèi)原料企業(yè)應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，改粗品生產(chǎn)為精品生產(chǎn)，變粗品出口為精品出口，以精品占領(lǐng)國(guó)際市場(chǎng)，獲取更大利潤(rùn)。如若實(shí)現(xiàn)聚谷氨酸以谷氨酸為底物的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，將為我國(guó)的氨基酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展開(kāi)拓廣闊的國(guó)際生存空間。隨著分子生物學(xué)新技術(shù)的應(yīng)用，利用基因工程方法構(gòu)建聚谷氨酸工程菌將從根本上解除制約聚谷氨酸生產(chǎn)的瓶頸問(wèn)題，為氨基酸發(fā)酵行業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)［14］。研究意義高分子材料是分子量高達(dá)數(shù)萬(wàn)至數(shù)百萬(wàn)的巨大“高分子”聚合而成的材料，具有許多優(yōu)異性能．以及生產(chǎn)、應(yīng)用的投資比其他材料低．在許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。尤其到了上世紀(jì)80年代．工業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家的鋼鐵產(chǎn)量已經(jīng)出現(xiàn)了衰退，而塑料仍以高速度在發(fā)展，如美國(guó)在過(guò)去的40年里的塑料產(chǎn)量猛增了100倍。但是，合成高分子材料在21世紀(jì)面臨了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，主要來(lái)自三個(gè)方面：首先，合成高分子材料的性能還需改進(jìn)；其次，合成高分子材料的循環(huán)使用和生物降解性差，隨著大量高分子材料在各個(gè)領(lǐng)域的使用，廢棄物對(duì)環(huán)境的污染有著日益加劇的趨勢(shì)，如廢塑料所造成的“白色污染”已成為世界性的公害；再次，合成高分子材料的主要原料-石油是不可再生資源，其儲(chǔ)量越來(lái)越少，隨著國(guó)內(nèi)外“白色污染”日益嚴(yán)重和能源危機(jī)的出現(xiàn)，可持續(xù)發(fā)展的環(huán)境友好高分子材料的開(kāi)發(fā)逐漸得到世界各國(guó)的重視，因而降解性高分子材料成為21世紀(jì)最具發(fā)展前景的高分子材料。世界工業(yè)的一大新趨向是開(kāi)發(fā)“綠色化學(xué)產(chǎn)品”（即對(duì)環(huán)境無(wú)害的化工產(chǎn)品）。聚合氨基酸系列產(chǎn)品已在“綠色化學(xué)產(chǎn)品”中嶄露頭角。日本是世界上最大氨基酸生產(chǎn)國(guó)與輸出國(guó)，日本科學(xué)家在聚合氨基酸的研究開(kāi)發(fā)已領(lǐng)先于世界。近年來(lái)國(guó)外研究日趨熱門，而國(guó)內(nèi)少有相關(guān)的研究報(bào)道[15]，中國(guó)在這方面的研究尚處于起步階段，只有少數(shù)科研單位進(jìn)行聚氨基酸的研究和開(kāi)發(fā)，如聚谷氨酸高吸水性樹脂、聚谷氨酸-表阿霉素偶合物等，但研究的深度、廣度等均與國(guó)外有較大的差距，研究工作僅限于實(shí)驗(yàn)室，離產(chǎn)業(yè)化有較大的距離，因此建立完整、系統(tǒng)、大規(guī)模的聚谷氨酸微生物生產(chǎn)方法是今后亟待解決的課題之一。第二部分課程設(shè)計(jì)部分不同分子量聚谷氨酸制備條件研究微生物合成的Y-PGA是一種水溶性的可生物降解的生物高分子，相對(duì)分子質(zhì)量在1萬(wàn)-100萬(wàn)，個(gè)別能達(dá)到200萬(wàn)。它完全無(wú)毒害作用，甚至可以直接食用。聚谷氨酸及其衍生物可廣泛的應(yīng)用在食品工業(yè)、化妝品、保健、水處理、廢水處理、衛(wèi)生用品、醫(yī)療以及水凝膠等領(lǐng)域，而區(qū)別其應(yīng)用領(lǐng)域的主要指標(biāo)則是Y-PGA的分子量。按照其應(yīng)用領(lǐng)域所需要的分子量大小的差異，可以將Y-PGA分成四個(gè)級(jí)別，分別是：肥料級(jí)，0.5-1萬(wàn)單位；食品級(jí)，10-70萬(wàn)單位；化妝品級(jí)，70-110萬(wàn)單位；藥品級(jí)，120-200萬(wàn)單位。由于發(fā)酵法生產(chǎn)的y-PGA相對(duì)分子質(zhì)量比較大，可以通過(guò)酸水解將其降解為不同相對(duì)分子質(zhì)量的y-pga，由于其降解分子量的不同，可以用于不同的行業(yè)，可大大推進(jìn)其工業(yè)化生產(chǎn)與市場(chǎng)化應(yīng)用之間的聯(lián)系。

1.材料1.1實(shí)驗(yàn)原料和試劑牛肉膏檸檬酸蛋白胨甘油硅膠磷酸二氫鈉SDS-分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白蒸餾水氯化鈉L-谷氨酸瓊脂鹽酸1.2實(shí)驗(yàn)器材722分光光度計(jì)上海第三分析儀器廠pH計(jì)北京屺源電子設(shè)備儀器公司電泳儀中國(guó)上海滬西分析儀器廠冷凍干燥機(jī)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器公司TGLl6C離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠薄層層析設(shè)備北京化學(xué)試劑公司超凈工作臺(tái)哈爾濱東聯(lián)電子設(shè)備有限公司恒溫水浴鍋北京醫(yī)療設(shè)備廠電熱恒溫培養(yǎng)箱湖北黃石醫(yī)療儀器廠電熱式壓力蒸汽消毒器上海博迅設(shè)備廠電熱恒溫水浴鍋吳江宏成電熱設(shè)備有限公司SNB-1型旋轉(zhuǎn)式粘度劑上海精密儀器有限公司2.方法2.1微生物培養(yǎng)方法2.1.1平板培養(yǎng)取富集培養(yǎng)液1ml，采用十倍梯度稀釋方法涂布于裝有選擇性培養(yǎng)基的平板上，之后37"C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。2.1.2種子培養(yǎng)從保藏斜面上取一至兩環(huán)菌接入種子培養(yǎng)基中，于37"C、150r/min下?lián)u床培養(yǎng)24h。2.1.3搖瓶發(fā)酵發(fā)酵以2%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基（50mL/300mL錐形瓶）中.于37°C、150r/min下?lián)u床培養(yǎng)96h。2.2y-PGA的純化方法菌體的分離將發(fā)酵液在12000rpm條件下離心30min,取上清液備用。乙醇沉淀將上清夜加入4倍體積的乙醇,攪動(dòng)后置于低溫過(guò)夜,12000rpm,30min離心收集沉淀物用去離子水洗滌沉淀物2次合并上清夜,再用4倍體積乙醇沉淀,12000rpm,30min離心,反復(fù)三次,收集沉淀物［17］。丙酮分級(jí)沉淀將乙醇沉淀后的粗樣品溶解在0.015mol/L,pH6.98的磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀緩沖溶液中,加入4倍體積預(yù)冷的丙酮,12000rpm離心30min,分離沉淀,在上清夜中繼續(xù)加入原體積8倍的預(yù)冷丙酮,12000rpm離心30min,收集沉淀。透析袋透析除鹽把丙酮分級(jí)沉淀提取得到的沉淀物倒入截留分子量8000?12000的透析袋內(nèi)，在電磁攪拌器上4C進(jìn)行透析40min,其間10分鐘換水一次。在此之后,將透析袋中的沉淀物冷凍干燥。生理指標(biāo)的測(cè)定方法按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件，將高分子的y-pga降解為低分子的聚谷氨酸,之后經(jīng)膜過(guò)濾截留得到分子量為10000~100000的低聚谷氨酸。其中膜過(guò)濾過(guò)程中所使用的膜型號(hào)為PS10，截留分子量為10000，為內(nèi)壓式；PP100,截留分子量為100000,為外壓式,膜材料均為中空纖維,工作時(shí)控制壓力在0.1MPa以下。使用前先用0.2%的NaOH溶液清洗，再用自來(lái)水、蒸餾水清洗方可進(jìn)行截留。2.3.1降解程度檢測(cè)將降解后的小分子聚谷氨酸配制成濃度為20mg/mL的溶液2mL,之后用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定分子量。所用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量依次為14.4KDa，20.2KDa，26.0KDa，35.0KDa，45.0KDa，66.2KDa，94.0KDa。具體操作如下：(1)制備瓊脂糖凝膠制備1%瓊脂糖凝膠：稱取0.7g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入70mL1XTAE,瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1%瓊脂糖凝膠液。膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65°C左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開(kāi)，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。(2)制備樣品和上樣樣品的處理：y-PGA樣品(濃度約為20mg/mL)與樣品緩沖液按1:1的比例混合，在100C水浴處理2?5min,Marker的處理方法相同。用移液槍將樣品加入樣品孔中，上樣量為15吐。將蛋白質(zhì)樣品加至樣品孔的底部，并隨著染料水平的升高而升高移液槍槍頭。避免帶入氣泡，氣泡易使樣品混入到相鄰的加樣孔中。電泳條件：電壓為75V,電流一般為50mA,電泳至溴酚蘭接近膠邊緣,結(jié)束電泳。(3)確定分子質(zhì)量粘度的測(cè)定取經(jīng)純化后的y-PGA.用蒸餾水按0g/L、0.3g/L、0.6g/L、0.9g/L、g/L、.5g/L、2g/L的濃度成不同梯度稀釋，調(diào)節(jié)pH值為7,用SNB—1數(shù)字型粘度計(jì)，25"C,3號(hào)轉(zhuǎn)子，12r/min測(cè)定。2.3.5pH穩(wěn)定性的測(cè)定取經(jīng)純化后的y-PGA,用超純水配制成一定濃度的y-PGA溶液，分別調(diào)節(jié)不同的pH值觀察粘度變化。3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1通過(guò)微生物發(fā)酵、提取得到80-100萬(wàn)分子量的聚谷氨酸產(chǎn)物的設(shè)計(jì)3.2單因素實(shí)驗(yàn)確定y-PGA降解工藝參數(shù)范圍的設(shè)計(jì)3.2.1溫度對(duì)y-PGA降解效果的影響通過(guò)翻閱相關(guān)文獻(xiàn)，在用酸水解y-PGA時(shí)，溫度越高，使得提供給肽鍵斷裂能量就越多，隨機(jī)斷裂肽鏈越頻繁，降解效果越好。通過(guò)選擇不同的溫度梯度，并且控制單一條件變量，從而考察在pH值為7的條件下水解8h，聚谷氨酸在不同溫度60,80,100°C下，對(duì)y-PGA降解效果的影響，記錄數(shù)據(jù)。pH值對(duì)y-PGA降解效果的影響通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，可以知道不同pH值條件下y-PGA降解趨勢(shì)相差很大。選擇不同的pH值在3,7,11,于以上最佳溫度培養(yǎng)下水解8h，以考察不同pH值對(duì)y-PGA降解效果的影響，記錄數(shù)據(jù)，并做成圖表。反應(yīng)時(shí)間對(duì)y-PGA降解效果的影響通過(guò)以上條件的設(shè)計(jì)，選擇出最佳的溫度以及pH,并在此條件下分別水解4,8,12h,以考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)y-PGA降解效果的影響，記錄數(shù)據(jù)，并做成圖表。正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化y-PGA降解工藝的設(shè)計(jì)根據(jù)以上三個(gè)單因素實(shí)驗(yàn),我們能確定并選擇出合適的y-PGA降解工藝參數(shù)范圍。為確定降解工藝中各個(gè)參數(shù)的效應(yīng)和交互作用,選擇出最優(yōu)水平組合,我們以低聚谷氨酸的獲得量為評(píng)價(jià)指標(biāo),選擇采用L9(33)正交表,以此進(jìn)行正交試驗(yàn),優(yōu)化y-PGA降解工藝體系物性參數(shù),確定影響y-PGA降解效果的各因素的主次順序,得出最佳的因素水平組合。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。水平因子A溫度（°C）BpHC反應(yīng)時(shí)間（h）1603.042807.08310011.0124.設(shè)計(jì)分析5總結(jié)體會(huì)我本次課程設(shè)計(jì)選擇的題目是《不同分子量聚谷氨酸制備條件研究》，起初選到這個(gè)題目不知道從何入手，通過(guò)參閱大量的文獻(xiàn)，逐步有些思路，國(guó)內(nèi)對(duì)其研究最近幾年比較火，而國(guó)外對(duì)其研究已經(jīng)逐漸趨于成熟，故激起了我很大的興趣，所以對(duì)于課題也就逐漸有了自己的想法。首先對(duì)于聚谷氨酸的合成一般通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生，而對(duì)于人來(lái)說(shuō)，吃得好才能生長(zhǎng)的好，才能有足夠的精力投入生產(chǎn)實(shí)踐當(dāng)中；以此為契機(jī)，要想讓微生物能夠更好更快的生產(chǎn)聚谷氨酸，故從培養(yǎng)基入手，而微生物生長(zhǎng)繁殖所必須的營(yíng)養(yǎng)條件無(wú)非就是碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、水；看問(wèn)題要抓關(guān)鍵，抓主流，若一一入手，不但操作繁瑣，而且也分散精力，故本設(shè)計(jì)就從碳源、氮源、外界條件Ph以及補(bǔ)充谷氨酸入手，從而能夠?qū)ふ业阶罴训呐囵B(yǎng)基成分及理化性質(zhì)、以及最佳配比。其次，磨刀不誤砍柴工，只要有思路，有想法，課設(shè)就會(huì)很順利，才不會(huì)在大量的文獻(xiàn)中迷失自我，找不到重點(diǎn)，分不清主次，因此找準(zhǔn)關(guān)鍵至關(guān)重要。最后，感謝朱瑞艷老師對(duì)我們的悉心教導(dǎo)，老師的嚴(yán)謹(jǐn)治學(xué)的態(tài)度誨人不倦的精神和豐富的學(xué)識(shí)，以及這次的課程設(shè)計(jì)讓我受益匪淺，它是我學(xué)識(shí)和眼界的一次的拔高，而它將激勵(lì)我在今后的學(xué)習(xí)、生活、工作中更加嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致。此外，還要感謝我的同學(xué)在我設(shè)計(jì)過(guò)程中提供的幫助和支持，再次對(duì)朱老師和幫助過(guò)我的同學(xué)致以最誠(chéng)摯的謝意！參考文獻(xiàn)魏艷，張丹，蔡恒.適用于野生型枯草芽抱桿菌轉(zhuǎn)化有機(jī)溶劑方法的建立和優(yōu)化[J].生物學(xué)通報(bào),2011.15(12):51-64.王輝，董超，史延茂.多聚谷氨酸發(fā)酵的響應(yīng)面法優(yōu)化[J].食品研究與開(kāi)發(fā)2011(12).呂瑩，郝紫徽，李虹聚.Y-谷氨酸的分離提純[J]?食品與發(fā)酵工業(yè),2005(02).惠明，田青.BacillussubtilisB53合成聚谷氨酸的分批發(fā)酵分析[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(1):13-16.MuraoS.Onthepolyglutamicacidfermentation.Koubunshi，1969，16:1204-1212.ShiFeng，XuZhinan，CenPeilinMicrobialproduc