聚谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)

課程設(shè)計說明書不同分子量聚谷氨酸制備條件研究學(xué)院（系） 年級專業(yè)： 學(xué)號: 學(xué)生姓名：指導(dǎo)教師： 教師職稱： 2013-2014春季學(xué)期生物工程專業(yè)課程設(shè)計結(jié)題論文不同分子量聚谷氨酸制備條件研究學(xué)院（系）： 年級專業(yè)： 學(xué)號: 學(xué)生姓名： 指導(dǎo)教師： 教師職稱： 摘要Y-PGA是一種有極大開發(fā)價值和前景的多功能性生物制品，近年來被作為增稠劑，保濕劑，藥物載體等而一直被廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域。它是一種水溶性和可生物降解的新型生物高分子材料，可通過微生物合成。在生產(chǎn)低聚谷氨酸工藝當(dāng)中，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)聚谷氨酸具有很好的前景，但在利用微生物發(fā)酵法制備產(chǎn)物時，生產(chǎn)的聚谷氨酸具有較大的分子量，需要對其進(jìn)行進(jìn)一步的降解處理。本設(shè)計擬對微生物發(fā)酵生產(chǎn)的高分子量的聚谷氨酸進(jìn)行降解，并優(yōu)化其降解條件，從而得到不同分子量的低聚谷氨酸分子，并利用瓊脂糖凝膠電泳和高效液相凝膠色譜檢測其降解后的分子量，從而確定最佳降解條件。本設(shè)計主要分為三個部分對不同分子量的Y-PGA的制備情況進(jìn)行了研究。第一部分是通過微生物發(fā)酵，提取得到80-100萬分子量的大分子聚谷氨酸產(chǎn)物的設(shè)計；第二部分根據(jù)聚谷氨酸分子特性，設(shè)計篩選可降解大分子聚谷氨酸的方法，并優(yōu)化降解條件，得到不同分子量的低聚谷氨酸分子，并找到合適的方法進(jìn)行分離純化；第三部分是在前兩部分的基礎(chǔ)上，通過建立瓊脂糖凝膠電泳和液相凝膠色譜檢測不同分子量低聚谷氨酸的方法，從而設(shè)計出最佳的制備條件。關(guān)鍵詞：生物發(fā)酵法、聚谷氨酸、降解條件、檢測方法目錄TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"第一部分文獻(xiàn)綜述 3\o"CurrentDocument"Y-聚谷氨酸簡介 3\o"CurrentDocument"1.2聚谷氨酸結(jié)構(gòu) 41.3聚谷氨酸性質(zhì)： 41.3.1吸水特性 4生物可降解性 4y-PGA的水解特性 5\o"CurrentDocument"y-PGA的應(yīng)用前景 5\o"CurrentDocument"y-PGA的應(yīng)用 52.1.1聚y-PGA是一種微生物絮凝劑 5y-PGA作為一種新型的高分子吸水性材料 5y-PGA作為新型的藥物載體 6\o"CurrentDocument"y-PGA合成方法 7\o"CurrentDocument"3.1化學(xué)法合成 73.1.1傳統(tǒng)的肽合成法 73.1.2二聚體縮聚法 7\o"CurrentDocument"3.2提取法合成 7\o"CurrentDocument"3.3微生物生物合成法 7\o"CurrentDocument"3.3.1代謝途徑 7\o"CurrentDocument"研究進(jìn)展 8\o"CurrentDocument"總結(jié)——本設(shè)計的前景分析以及研究意義 8\o"CurrentDocument"5.1前景分析 8\o"CurrentDocument"5.2研究意義 9\o"CurrentDocument"第二部分課程設(shè)計部分 101?材料 10\o"CurrentDocument"1.1實驗原料和試劑 101.2實驗器材 112.方法 112.1微生物培養(yǎng)方法 11平板培養(yǎng) 11\o"CurrentDocument"種子培養(yǎng) 11\o"CurrentDocument"搖瓶發(fā)酵 11\o"CurrentDocument"2.2YGA的純化方法 12菌體的分離 12\o"CurrentDocument"乙醇沉淀 122.2.3丙酮分級沉淀 122.2.4透析袋透析除鹽 122.2.5硅膠薄層層析 錯誤!未定義書簽。\o"CurrentDocument"2.3生理指標(biāo)的測定方法 12生物量測定 錯誤!未定義書簽。細(xì)胞數(shù)測定 錯誤!未定義書簽。分子量分析 12粘度的測定 13\o"CurrentDocument"pH穩(wěn)定性的測定 132.4碳源試驗 錯誤!未定義書簽。2.5氮源試驗 錯誤!未定義書簽。2.6前體物質(zhì)L-谷氨酸試驗 錯誤!未定義書簽。2.7碳源、氨源、前體物質(zhì)正交試驗 錯誤!未定義書簽。2.8無機(jī)離子正交試驗 錯誤!未定義書簽。TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"3.實驗設(shè)計 133.1培養(yǎng)基營養(yǎng)成分對聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計 14培養(yǎng)基中不同碳源對聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計 14培養(yǎng)基中不同氮源對聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計 14培養(yǎng)基中前體谷氨酸對聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計 143.2培養(yǎng)基中碳源、氨源、前體物質(zhì)正交試驗的設(shè)計 143.3不同pH對不同分子量聚谷氨酸影響的設(shè)計分析?錯誤!未定義書簽。\o"CurrentDocument"4.設(shè)計分析 154.1培養(yǎng)基營養(yǎng)成分對聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計??…錯誤!未定義書簽。4.1.1碳源對產(chǎn)物r-PGA分子量合成的影響的設(shè)計分析錯誤！未定義書簽。培養(yǎng)基中不同氮源對聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計分析錯誤!未定義書簽。培養(yǎng)基中前體谷氨酸對聚谷氨酸分子量影響的設(shè)計錯誤!未定義書簽。4.2培養(yǎng)基中碳源、氨源、前體物質(zhì)正交試驗的設(shè)計??錯誤!未定義書簽。4.3不同pH對不同分子量聚谷氨酸影響的設(shè)計分析?錯誤!未定義書簽。5總結(jié)體會 15參考文獻(xiàn) 16第一部分文獻(xiàn)綜述1.概況背景1.1Y-聚谷氨酸簡介Y-聚谷氨酸(Y-PGA)是一種由微生物生物合成的聚谷氨酸，它由D-谷氨酸單體或L-谷氨酸單體以羧基和氨基相縮合而成⑴。在生物體內(nèi)y-PGA生物相容性良好，可以降解為谷氨酸而直接被生物體吸收，對于用作生物醫(yī)用材料有明顯優(yōu)點(diǎn)。另外，主鏈上有大量游離羧基存在，使y-pga具有水溶性聚羧酸的性質(zhì)，如強(qiáng)吸水和保濕性能，可用于化妝品、食品、分散劑、螯合劑、建筑涂料、防塵等領(lǐng)域23］。這些活性位點(diǎn)為材料的功能化提供了條件。由于其良好的環(huán)境友好性，在注重環(huán)保強(qiáng)調(diào)可持續(xù)發(fā)展的今天，這種來自生物的可降解型功能材料受到人們的青睞。1.2聚谷氨酸結(jié)構(gòu)對Y-PGA的氨基酸組分分析表明，該物質(zhì)只有谷氮酸一種氨基酸組成，其純化樣品在216nm處有吸收峰，與典型蛋白質(zhì)吸收峰不同。丫-PGA經(jīng)硅膠層析后，用不同官能團(tuán)顯色劑處理，a—萘酚、間苯二酚、甲基苯二酚反應(yīng)呈陰性，雙縮脲反應(yīng)陰性而茚三酮反應(yīng)陽性，該物質(zhì)沒有典型的肽鏈結(jié)構(gòu)，也不是一種環(huán)狀多肽。隨著溫度的提高，y-pga水溶液在一定的溫度范圍內(nèi)粘度變化不大，聚合物結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。在高溫下，粘度下降快.y-pga水解也很快，分子量逐漸變小，y-pga的水解是由鏈的隨機(jī)切割引起的。不同生產(chǎn)方式得到的y-pga的分子量有差異，如采用地衣芽抱桿菌搖瓶發(fā)酵得到的Y-PGA的分子量為1.06x105Da，而通過5L發(fā)酵罐生產(chǎn)的丫-PGA的分子量為2.47x105Da。丫-PGA的等電點(diǎn)為3.47，它是一種酸性氮基酸聚合物。1.3聚谷氨酸性質(zhì)：1.3.1吸水特性由于y-pga極易溶于水，因此其具有很好的吸水特性，王傳海等對y-pga的吸水性能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，y-pga的最大自然吸水倍數(shù)可達(dá)到1108倍，比目前市售的聚丙烯酸鹽類吸水樹脂高1倍以上，對土壤水分的吸收倍數(shù)為30-80倍。y-PGA的水浸液在土壤中具有一定的保水力和較理想的釋放效果，有明顯的抗旱促苗效應(yīng)。在0.206mol/L濃度的PEG(6000)模擬滲透脅迫條件下，y-pga仍有較強(qiáng)的吸水和保水能力，可明顯提高小麥和黑麥草的發(fā)芽率，用其直接拌種也能顯著提高種子的發(fā)芽率⑸。y-pga的吸水性和保水性可使y-pga被廣泛應(yīng)用于干旱地區(qū)保水以及沙漠綠化。生物可降解性生物可降解性是y-pga的特性之一。所有y-pga產(chǎn)生菌株都可以以y-pga作為營養(yǎng)源進(jìn)行生長。在培養(yǎng)液中存在一種與y-pga降解有關(guān)的解聚酶。其它自然菌株也具有降解y-pga的能力。以y-pga作為唯一碳源和氮源對可降解r-PGA的菌株進(jìn)行篩選，結(jié)果篩選出至少12株可降解r-PGA的菌株⑹。由此可知，發(fā)酵生產(chǎn)y-pga的培養(yǎng)時間對產(chǎn)量有較大的影響，時間過長會導(dǎo)致y-pga分子被酶解而損失。r-PGA的水解特性r-PGA的水溶液在10mL、濃度為6mol/L的HC1中，抽真空封口，105°C的烘箱的條件下可以水解為谷氨酸，呂瑩等m的研究表明，水解17h、25h、48h的結(jié)果一致。此特性可用于r-PGA純度的測定。2?-pGA的應(yīng)用前景y-PGA的應(yīng)用r-PGA是一種天然存在的水溶性的聚合氨基酸，具有生物可降解性，可食用且對人體和環(huán)境無毒害。近年來其被作為生物絮凝劑，增稠劑，加濕劑，藥物載體，藥物緩釋劑，生物可降解纖維，高吸水性樹脂，重金屬吸收劑以及食品添加劑等一直被廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域如食品工業(yè)，藥物工業(yè)，化妝品工業(yè)及污水處理中，是一種有極大開發(fā)價值和前景的多功能新型生物制品。2.1.1聚r-PGA是一種微生物絮凝劑r-PGA可以用作飲用水、廢水、發(fā)酵食品工業(yè)下游過程溶液的生物絮凝劑以及重金屬或放射性物質(zhì)螯合劑，用于回收金屬盒減少環(huán)境污染等。y-PGA作為一種新型的高分子吸水性材料近年來，人們把水溶性高分子作為精細(xì)化工的骨干產(chǎn)品之一，越來越受到人們的重視。它的應(yīng)用范圍幾乎涉及人所能涉及的任何領(lǐng)域。隨著高分子材料的快速發(fā)展，在其重要性日益突現(xiàn)的同時，人們發(fā)現(xiàn)了它的不足之處，即大部分的人工合成的高分子材料在自然界難以降解。在人們越來越關(guān)心自己生存環(huán)境的今天，不可降解的高分子材料造成的“白色污染”（如聚乙烯、聚丙烯等），也越來越受到人們的關(guān)注。為了解決這個問題，人們開展了各種研究工作。制成了各種可生物降解材料［8］。在日本，聚谷氨酸得到廣泛應(yīng)用，主要以谷氨酸Y-甲基酯為基礎(chǔ)，生產(chǎn)新型聚合物IITC。此類聚合物可以用來制造皮革、纖維、食品包裝膜等。聚合D-谷氨酸用苯乙烯改性后，可得到高抗堿性的纖維樹脂。若通過改性再聚合，可得到比一般天然纖維和化學(xué)纖維更優(yōu)的材料，如外科手術(shù)的縫合線，就是以氨基酸和羧酸為基礎(chǔ)，由易水解纖維狀和薄膜狀的聚合物制得的。而滲透殺菌劑、防腐劑、抗生素的聚合氫基酸對傷口和皮膚病還有防治作用。以谷氨酸和烷基谷氨酸酯的共聚物為基礎(chǔ)，研制出來的聚合物是藥品很好的包裹材料，可作膠囊或糖衣片。日本九州大學(xué)原敏夫等人通過大豆發(fā)酵，提取y-PGA，用電子柬照射，制成y-PGA樹脂，這種物質(zhì)呈白色粉末狀，具有極強(qiáng)的吸水性，其吸水性能是紙和尿不濕的5倍。y-PGA吸水飽和后，呈凝膠狀，可包裹在植物種子的表面上作為種子的理想包衣材料。原敏夫認(rèn)為，這種樹脂是沙漠綠化的好武器，并提出了中國綠化沙漠的設(shè)想（原敏夫特開平）。另外，y-PGA作為一種凝膠材料，也可以起分子篩作用［9］。y-PGA作為新型的藥物載體y-PGA具有良好的生物親和性和生物降解性，作為藥物載體可提供藥物緩釋性、靶向性，提高藥物水溶性，降低藥物不良反應(yīng)，從而提高藥物療效。（1）用作金屬螫合物抗癌藥物順二氯二氨鉑（CDDP）的載體該藥物為重金屬絡(luò)合物，微溶于水，且在水中不穩(wěn)定，療效低，對細(xì)胞毒性大，用y-PGA（相對分子量4x104）作為藥物載體，可形成有活性的、相對穩(wěn)定的CDDP-PGA復(fù)合物，該復(fù)臺物有較高的動力學(xué)穩(wěn)定性和對正常細(xì)胞較低的毒性，有利于Pt2+對配體的親和，而且其治療劑量范圍寬。（2）作為水不溶性植物類化療藥物的載體化療藥物大多難溶或不溶于水，細(xì)胞毒性大，選擇性小。如喜樹堿難溶于水，而且它的內(nèi)酯形式不穩(wěn)定，導(dǎo)致使用受限制，療效低。但10-羥CPT或9-氨基CPT與PGA偶聯(lián)形成CPT-PGA復(fù)合物后，水溶性大為增加。復(fù)合物對同源的和異源的腫瘤都保持較高的抗腫瘤活性。（3）用作抗生素類抗癌藥物阿霉素的載體，可明顯地提高療效。（4） y-PGA的半乳糖或甘露糖酯化衍生物可作為肝細(xì)胞特殊藥物的載體，通過糖酯化的PGA的結(jié)合作用把相對分子量低的藥物運(yùn)送到肝細(xì)胞中，起到了靶向作用。（5） y-PGA與明膠有較好的兼容性，適合制作外科及手術(shù)用的可生物降解的粘膠劑、止血劑及密封劑［10］。3.YGA合成方法化學(xué)法合成傳統(tǒng)的肽合成法傳統(tǒng)的肽合成法是將氨基酸逐個連接形成多肽，這個過程一般包括基團(tuán)保護(hù)、反應(yīng)物活化、偶聯(lián)和脫保護(hù)。化學(xué)合成法是肽類合成的重要方法，但合成路線長、副產(chǎn)物多、收率低，尤其是含20個氨基酸以上的純多肽合成［11］。二聚體縮聚法由L-Glu、D-Glu及消旋體（D,L-Glu）反應(yīng)生成a-甲基谷氨酸，后者凝聚成谷氨酸二聚體后，再與濃縮劑1，3-二甲氨丙基-3-乙基碳亞二胺鹽酸鹽及1-羥苯基三吡咯水合物在N,N-二甲基甲酰胺中發(fā)生凝聚，獲得產(chǎn)率為44%~91%、相對分子質(zhì)量為5000~20000的聚谷氨酸甲基酯，經(jīng)堿性水解變成y-pga?；瘜W(xué)合成法難度很大，沒有工業(yè)應(yīng)用價值。提取法合成早期，日本生產(chǎn)y-pga大多采用提取法，用乙醇將納豆（一種日本的傳統(tǒng)食品）中的y-PGA分離提取出來。由于納豆中所含的y-PGA濃度甚微，且有波動，因此提取工藝十分復(fù)雜，生產(chǎn)成本甚高，同樣難以大規(guī)模生產(chǎn)。微生物生物合成法迄今為止的發(fā)酵生產(chǎn)仍處于試驗室階段，小試生產(chǎn)方法歸納起來主要有分批發(fā)酵法、連續(xù)發(fā)酵法、液體兩相發(fā)酵法、攪拌罐反應(yīng)器自循環(huán)發(fā)酵法、固體發(fā)酵法和固定化酶法等6種，分批發(fā)酵法簡單方便，容易操作和控制，因此在實驗室研究中用的較為廣泛。3.3.1代謝途徑自從1942年Bovarnick等發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬微生物能在培養(yǎng)基中蓄積Y-PGA以來，利用微生物生物聚合生成Y-PGA的研究十分活躍。人們對不同的微生物進(jìn)行了代謝途徑分析，由于分析手段和其他人為原因的限制，以致現(xiàn)在y-PGA的代謝途徑仍然是一個黑箱模型。4.研究進(jìn)展由于y-pga具有環(huán)境友好等特性使其應(yīng)用日益廣泛，對其研究越來越多，然而目前國內(nèi)主要是對y-pga生產(chǎn)方面尤其是菌種及發(fā)酵條件的研究，而且大多數(shù)發(fā)酵生產(chǎn)仍處于試驗室階段，實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化還有一定距離。國外對其應(yīng)用研究則比較多，尤其是在附加值比較高的醫(yī)藥領(lǐng)域。在今后研究中，一方面是在提高y-PGA產(chǎn)量同時建立一種生產(chǎn)成本低廉、生產(chǎn)工藝簡單、生產(chǎn)條件溫和的工藝，為大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)：另一方面是不斷擴(kuò)大應(yīng)用研究的廣度和深度，同時進(jìn)行創(chuàng)新性研究［12］。5.總結(jié)——本設(shè)計的前景分析以及研究意義前景分析近年國內(nèi)強(qiáng)大的需求釋放與巨大的產(chǎn)能缺口，是化工新材料被廣泛看好的最重要的理由。新材料技術(shù)是21世紀(jì)三大關(guān)鍵技術(shù)之一，是發(fā)展信息、航天、能源、生物等高新技術(shù)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)已成為全球經(jīng)濟(jì)增長的源動力和各國提升核心競爭力的焦點(diǎn)。包括新的功能聚合物、復(fù)合材料、高性能化的通用塑料新品種、可降解塑料、納米材料等。與傳統(tǒng)化工材料相比。它們具有優(yōu)異性能或特殊功能．對國民經(jīng)濟(jì)特別是高技術(shù)領(lǐng)域及尖端技術(shù)有重要作用。長期以來，新材料產(chǎn)品及其原料對外依存度較高，一些高端品種甚至完全依賴進(jìn)口。而近年來．國內(nèi)龍頭企業(yè)通過不斷研發(fā)和創(chuàng)新，形成了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的工藝和技術(shù)，逐漸具有成本和規(guī)模優(yōu)勢，替代進(jìn)口前景廣闊。我國政府對新材料行業(yè)在各個層次上都有扶持性政策。在前瞻性研究方面，國家計劃每年對新材料項目援助在3.5億元左右：在產(chǎn)業(yè)項目方面，有火炬計劃、中小企業(yè)創(chuàng)新基金、國家科技攻關(guān)計劃等每年通過撥款和貼息貸款等形式給予資助；按照國家政策的精神．各地各級政府也都給予新材料企業(yè)出口補(bǔ)貼和稅收優(yōu)惠。這些政策的實施使中國新材料科技水平大大提高．同時引導(dǎo)大量的社會資金向新材料領(lǐng)域投資，促進(jìn)了新材料科技成果轉(zhuǎn)化，推動了新材料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。市場發(fā)展需要和國家政策導(dǎo)向都使得綠色生物環(huán)保材料企業(yè)的投資風(fēng)險降到比較低的水平［13］。我國氨基酸行業(yè)的主要競爭對手是日本，多年來與日本既競爭又合作。前些年，在我國不能生產(chǎn)原料時，對方輸入原料，同時輸入生產(chǎn)技術(shù)。現(xiàn)在我們可以生產(chǎn)氨基酸原料，對方則進(jìn)行精加工。所以國內(nèi)企業(yè)在產(chǎn)品精加工方面應(yīng)該重視，不應(yīng)僅停留在生產(chǎn)粗原料上。國內(nèi)原料企業(yè)應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，改粗品生產(chǎn)為精品生產(chǎn)，變粗品出口為精品出口，以精品占領(lǐng)國際市場，獲取更大利潤。如若實現(xiàn)聚谷氨酸以谷氨酸為底物的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，將為我國的氨基酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展開拓廣闊的國際生存空間。隨著分子生物學(xué)新技術(shù)的應(yīng)用，利用基因工程方法構(gòu)建聚谷氨酸工程菌將從根本上解除制約聚谷氨酸生產(chǎn)的瓶頸問題，為氨基酸發(fā)酵行業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展奠定堅實的基礎(chǔ)［14］。研究意義高分子材料是分子量高達(dá)數(shù)萬至數(shù)百萬的巨大“高分子”聚合而成的材料，具有許多優(yōu)異性能．以及生產(chǎn)、應(yīng)用的投資比其他材料低．在許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。尤其到了上世紀(jì)80年代．工業(yè)發(fā)達(dá)國家的鋼鐵產(chǎn)量已經(jīng)出現(xiàn)了衰退，而塑料仍以高速度在發(fā)展，如美國在過去的40年里的塑料產(chǎn)量猛增了100倍。但是，合成高分子材料在21世紀(jì)面臨了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，主要來自三個方面：首先，合成高分子材料的性能還需改進(jìn)；其次，合成高分子材料的循環(huán)使用和生物降解性差，隨著大量高分子材料在各個領(lǐng)域的使用，廢棄物對環(huán)境的污染有著日益加劇的趨勢，如廢塑料所造成的“白色污染”已成為世界性的公害；再次，合成高分子材料的主要原料-石油是不可再生資源，其儲量越來越少，隨著國內(nèi)外“白色污染”日益嚴(yán)重和能源危機(jī)的出現(xiàn)，可持續(xù)發(fā)展的環(huán)境友好高分子材料的開發(fā)逐漸得到世界各國的重視，因而降解性高分子材料成為21世紀(jì)最具發(fā)展前景的高分子材料。世界工業(yè)的一大新趨向是開發(fā)“綠色化學(xué)產(chǎn)品”（即對環(huán)境無害的化工產(chǎn)品）。聚合氨基酸系列產(chǎn)品已在“綠色化學(xué)產(chǎn)品”中嶄露頭角。日本是世界上最大氨基酸生產(chǎn)國與輸出國，日本科學(xué)家在聚合氨基酸的研究開發(fā)已領(lǐng)先于世界。近年來國外研究日趨熱門，而國內(nèi)少有相關(guān)的研究報道[15]，中國在這方面的研究尚處于起步階段，只有少數(shù)科研單位進(jìn)行聚氨基酸的研究和開發(fā)，如聚谷氨酸高吸水性樹脂、聚谷氨酸-表阿霉素偶合物等，但研究的深度、廣度等均與國外有較大的差距，研究工作僅限于實驗室，離產(chǎn)業(yè)化有較大的距離，因此建立完整、系統(tǒng)、大規(guī)模的聚谷氨酸微生物生產(chǎn)方法是今后亟待解決的課題之一。第二部分課程設(shè)計部分不同分子量聚谷氨酸制備條件研究微生物合成的Y-PGA是一種水溶性的可生物降解的生物高分子，相對分子質(zhì)量在1萬-100萬，個別能達(dá)到200萬。它完全無毒害作用，甚至可以直接食用。聚谷氨酸及其衍生物可廣泛的應(yīng)用在食品工業(yè)、化妝品、保健、水處理、廢水處理、衛(wèi)生用品、醫(yī)療以及水凝膠等領(lǐng)域，而區(qū)別其應(yīng)用領(lǐng)域的主要指標(biāo)則是Y-PGA的分子量。按照其應(yīng)用領(lǐng)域所需要的分子量大小的差異，可以將Y-PGA分成四個級別，分別是：肥料級，0.5-1萬單位；食品級，10-70萬單位；化妝品級，70-110萬單位；藥品級，120-200萬單位。由于發(fā)酵法生產(chǎn)的y-PGA相對分子質(zhì)量比較大，可以通過酸水解將其降解為不同相對分子質(zhì)量的y-pga，由于其降解分子量的不同，可以用于不同的行業(yè)，可大大推進(jìn)其工業(yè)化生產(chǎn)與市場化應(yīng)用之間的聯(lián)系。

1.材料1.1實驗原料和試劑牛肉膏檸檬酸蛋白胨甘油硅膠磷酸二氫鈉SDS-分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白蒸餾水氯化鈉L-谷氨酸瓊脂鹽酸1.2實驗器材722分光光度計上海第三分析儀器廠pH計北京屺源電子設(shè)備儀器公司電泳儀中國上海滬西分析儀器廠冷凍干燥機(jī)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器公司TGLl6C離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠薄層層析設(shè)備北京化學(xué)試劑公司超凈工作臺哈爾濱東聯(lián)電子設(shè)備有限公司恒溫水浴鍋北京醫(yī)療設(shè)備廠電熱恒溫培養(yǎng)箱湖北黃石醫(yī)療儀器廠電熱式壓力蒸汽消毒器上海博迅設(shè)備廠電熱恒溫水浴鍋吳江宏成電熱設(shè)備有限公司SNB-1型旋轉(zhuǎn)式粘度劑上海精密儀器有限公司2.方法2.1微生物培養(yǎng)方法2.1.1平板培養(yǎng)取富集培養(yǎng)液1ml，采用十倍梯度稀釋方法涂布于裝有選擇性培養(yǎng)基的平板上，之后37"C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。2.1.2種子培養(yǎng)從保藏斜面上取一至兩環(huán)菌接入種子培養(yǎng)基中，于37"C、150r/min下?lián)u床培養(yǎng)24h。2.1.3搖瓶發(fā)酵發(fā)酵以2%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基（50mL/300mL錐形瓶）中.于37°C、150r/min下?lián)u床培養(yǎng)96h。2.2y-PGA的純化方法菌體的分離將發(fā)酵液在12000rpm條件下離心30min,取上清液備用。乙醇沉淀將上清夜加入4倍體積的乙醇,攪動后置于低溫過夜,12000rpm,30min離心收集沉淀物用去離子水洗滌沉淀物2次合并上清夜,再用4倍體積乙醇沉淀,12000rpm,30min離心,反復(fù)三次,收集沉淀物［17］。丙酮分級沉淀將乙醇沉淀后的粗樣品溶解在0.015mol/L,pH6.98的磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀緩沖溶液中,加入4倍體積預(yù)冷的丙酮,12000rpm離心30min,分離沉淀,在上清夜中繼續(xù)加入原體積8倍的預(yù)冷丙酮,12000rpm離心30min,收集沉淀。透析袋透析除鹽把丙酮分級沉淀提取得到的沉淀物倒入截留分子量8000?12000的透析袋內(nèi)，在電磁攪拌器上4C進(jìn)行透析40min,其間10分鐘換水一次。在此之后,將透析袋中的沉淀物冷凍干燥。生理指標(biāo)的測定方法按照正交實驗設(shè)計的條件，將高分子的y-pga降解為低分子的聚谷氨酸,之后經(jīng)膜過濾截留得到分子量為10000~100000的低聚谷氨酸。其中膜過濾過程中所使用的膜型號為PS10，截留分子量為10000，為內(nèi)壓式；PP100,截留分子量為100000,為外壓式,膜材料均為中空纖維,工作時控制壓力在0.1MPa以下。使用前先用0.2%的NaOH溶液清洗，再用自來水、蒸餾水清洗方可進(jìn)行截留。2.3.1降解程度檢測將降解后的小分子聚谷氨酸配制成濃度為20mg/mL的溶液2mL,之后用瓊脂糖凝膠電泳測定分子量。所用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量依次為14.4KDa，20.2KDa，26.0KDa，35.0KDa，45.0KDa，66.2KDa，94.0KDa。具體操作如下：(1)制備瓊脂糖凝膠制備1%瓊脂糖凝膠：稱取0.7g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入70mL1XTAE,瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1%瓊脂糖凝膠液。膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65°C左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。(2)制備樣品和上樣樣品的處理：y-PGA樣品(濃度約為20mg/mL)與樣品緩沖液按1:1的比例混合，在100C水浴處理2?5min,Marker的處理方法相同。用移液槍將樣品加入樣品孔中，上樣量為15吐。將蛋白質(zhì)樣品加至樣品孔的底部，并隨著染料水平的升高而升高移液槍槍頭。避免帶入氣泡，氣泡易使樣品混入到相鄰的加樣孔中。電泳條件：電壓為75V,電流一般為50mA,電泳至溴酚蘭接近膠邊緣,結(jié)束電泳。(3)確定分子質(zhì)量粘度的測定取經(jīng)純化后的y-PGA.用蒸餾水按0g/L、0.3g/L、0.6g/L、0.9g/L、g/L、.5g/L、2g/L的濃度成不同梯度稀釋，調(diào)節(jié)pH值為7,用SNB—1數(shù)字型粘度計，25"C,3號轉(zhuǎn)子，12r/min測定。2.3.5pH穩(wěn)定性的測定取經(jīng)純化后的y-PGA,用超純水配制成一定濃度的y-PGA溶液，分別調(diào)節(jié)不同的pH值觀察粘度變化。3.實驗設(shè)計3.1通過微生物發(fā)酵、提取得到80-100萬分子量的聚谷氨酸產(chǎn)物的設(shè)計3.2單因素實驗確定y-PGA降解工藝參數(shù)范圍的設(shè)計3.2.1溫度對y-PGA降解效果的影響通過翻閱相關(guān)文獻(xiàn)，在用酸水解y-PGA時，溫度越高，使得提供給肽鍵斷裂能量就越多，隨機(jī)斷裂肽鏈越頻繁，降解效果越好。通過選擇不同的溫度梯度，并且控制單一條件變量，從而考察在pH值為7的條件下水解8h，聚谷氨酸在不同溫度60,80,100°C下，對y-PGA降解效果的影響，記錄數(shù)據(jù)。pH值對y-PGA降解效果的影響通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，可以知道不同pH值條件下y-PGA降解趨勢相差很大。選擇不同的pH值在3,7,11,于以上最佳溫度培養(yǎng)下水解8h，以考察不同pH值對y-PGA降解效果的影響，記錄數(shù)據(jù)，并做成圖表。反應(yīng)時間對y-PGA降解效果的影響通過以上條件的設(shè)計，選擇出最佳的溫度以及pH,并在此條件下分別水解4,8,12h,以考察不同反應(yīng)時間對y-PGA降解效果的影響，記錄數(shù)據(jù)，并做成圖表。正交實驗優(yōu)化y-PGA降解工藝的設(shè)計根據(jù)以上三個單因素實驗,我們能確定并選擇出合適的y-PGA降解工藝參數(shù)范圍。為確定降解工藝中各個參數(shù)的效應(yīng)和交互作用,選擇出最優(yōu)水平組合,我們以低聚谷氨酸的獲得量為評價指標(biāo),選擇采用L9(33)正交表,以此進(jìn)行正交試驗,優(yōu)化y-PGA降解工藝體系物性參數(shù),確定影響y-PGA降解效果的各因素的主次順序,得出最佳的因素水平組合。正交實驗因素與水平設(shè)計見表3。水平因子A溫度（°C）BpHC反應(yīng)時間（h）1603.042807.08310011.0124.設(shè)計分析5總結(jié)體會我本次課程設(shè)計選擇的題目是《不同分子量聚谷氨酸制備條件研究》，起初選到這個題目不知道從何入手，通過參閱大量的文獻(xiàn)，逐步有些思路，國內(nèi)對其研究最近幾年比較火，而國外對其研究已經(jīng)逐漸趨于成熟，故激起了我很大的興趣，所以對于課題也就逐漸有了自己的想法。首先對于聚谷氨酸的合成一般通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生，而對于人來說，吃得好才能生長的好，才能有足夠的精力投入生產(chǎn)實踐當(dāng)中；以此為契機(jī)，要想讓微生物能夠更好更快的生產(chǎn)聚谷氨酸，故從培養(yǎng)基入手，而微生物生長繁殖所必須的營養(yǎng)條件無非就是碳源、氮源、能源、生長因子、無機(jī)鹽、水；看問題要抓關(guān)鍵，抓主流，若一一入手，不但操作繁瑣，而且也分散精力，故本設(shè)計就從碳源、氮源、外界條件Ph以及補(bǔ)充谷氨酸入手，從而能夠?qū)ふ业阶罴训呐囵B(yǎng)基成分及理化性質(zhì)、以及最佳配比。其次，磨刀不誤砍柴工，只要有思路，有想法，課設(shè)就會很順利，才不會在大量的文獻(xiàn)中迷失自我，找不到重點(diǎn)，分不清主次，因此找準(zhǔn)關(guān)鍵至關(guān)重要。最后，感謝朱瑞艷老師對我們的悉心教導(dǎo)，老師的嚴(yán)謹(jǐn)治學(xué)的態(tài)度誨人不倦的精神和豐富的學(xué)識，以及這次的課程設(shè)計讓我受益匪淺，它是我學(xué)識和眼界的一次的拔高，而它將激勵我在今后的學(xué)習(xí)、生活、工作中更加嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致。此外，還要感謝我的同學(xué)在我設(shè)計過程中提供的幫助和支持，再次對朱老師和幫助過我的同學(xué)致以最誠摯的謝意！參考文獻(xiàn)魏艷，張丹，蔡恒.適用于野生型枯草芽抱桿菌轉(zhuǎn)化有機(jī)溶劑方法的建立和優(yōu)化[J].生物學(xué)通報,2011.15(12):51-64.王輝，董超，史延茂.多聚谷氨酸發(fā)酵的響應(yīng)面法優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)2011(12).呂瑩，郝紫徽，李虹聚.Y-谷氨酸的分離提純[J]?食品與發(fā)酵工業(yè),2005(02).惠明，田青.BacillussubtilisB53合成聚谷氨酸的分批發(fā)酵分析[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，28(1):13-16.MuraoS.Onthepolyglutamicacidfermentation.Koubunshi，1969，16:1204-1212.ShiFeng，XuZhinan，CenPeilinMicrobialproduc