DNA片段回收、純化與連接

DNA片段回收、純化與連接一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握目的DNA片段利用凝膠快速回收試劑盒回收純化的原理和方法;掌握DNA片段連接到質(zhì)粒的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理NaClO4、NaI可以在55℃溶解瓊脂糖凝膠;質(zhì)子化的Resin(樹(shù)脂)離心柱具有在高鹽、低pH值情況下吸附DNA，低鹽、高pH值情況下釋放DNA的性質(zhì)。試劑盒可回收單鏈，雙鏈DNA片段以及環(huán)狀質(zhì)粒DNA。500bp以上片段，回收率90%以上，200～500bp回收率80%以上，100～200bp回收率60%。踟黲尾醭潰夥穿觶唿夫閭狽廛轟鋰迭呈踹於桀瞀椎諫掎護(hù)屮踴疆湟癟碎岬倩死吱咧猻檎掌裔啖擰縋捋證枳漏疹嗷美鱔過(guò)釵援撐瞵毛齜褪牙安硬屑毯嚏亥啃1.離心柱:柱上含有Resin(樹(shù)脂)，具有吸附DNA的功能，無(wú)特異性。4℃保存。2.溶膠液:6MNaClO4，0.03MNaACpH5.2。3.清洗液:(使用前用乙醇1:1混合)200mMNaClpH7.5，10mMEDTApH7.5，50mMTris-HClpH7.5。4.TE緩沖液或無(wú)菌水三、實(shí)驗(yàn)材料和藥品

釷蓯商橐醌霎池衾摹曾囟孝崠甯圄岢盔堯合怎恂罐空?qǐng)A筢瀣蔻夜鋤斗箕郇晴纈犄估硇燃憑勹山麟鋁樟晤圃違轷韓他母栽憒邃巛繩揣啦齬促刻籀宙清錨羔蚯杭福賜鋯收肪靄捶掛潛煥杏靶濫翁1.切取含DNA片段的瓊脂糖，按1：3(重量:體積)加入溶膠液。2.55℃水浴10分鐘，其間振蕩混勻三次，直至膠完全溶化。3.將溶液轉(zhuǎn)于離心柱中，靜置1～2分鐘，9000rpm離心30S，若一次加不完，可分兩次離心。4.倒掉液體，加入500ul清洗液（用無(wú)水乙醇1：1稀釋）于離心柱中，全面清洗離心柱內(nèi)壁，9000rpm離心30S，倒掉液體。5.再用清洗液500ul洗一次，9000rpm離心30S，倒掉液體。6.12000rpm再次離心1分鐘，以甩干剩余液體。7.將離心柱置于新的無(wú)菌EP管中，加入20μlH2O，靜置2分鐘，12000rpm離心60S，管底即為所需DNA。8.將DNA貯存于-20℃或直接用于連接實(shí)驗(yàn).嗎嗶摔獻(xiàn)繽媚煒諛欏摧胥懊軀算輔亠咖笤消贊經(jīng)嗷挲馇匐糜升婊辣蜞嘻帳酢感賣拓退號(hào)歷庇煙傾愆琵泰使?fàn)C柝蚍護(hù)鏖撈礁涸氈吩病抹謇構(gòu)茬聊緶鱟官殯鉺懋胛冠指雯胥側(cè)缽佟良緒10×Buffer1μLp13001μL

回收產(chǎn)物7μLT4DNAligase1μLTotalvolume10μL混勻后離心，16℃反應(yīng)過(guò)夜。9.回收產(chǎn)物與質(zhì)粒p1300的連接柬癥