聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實(shí)驗(yàn)方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。典型的PCR由(1)高溫變性模板；(2)引物與模板退火；(3)引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下(通常為93°C-94°C)使其變性解成單鏈；人工合成的兩個(gè)寡核甘酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短；耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在72C將單核甘酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙?’一3’方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克、微克、毫克級(jí)的特異性DNA片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核甘酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機(jī)制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有著以下多種用途：生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針；由少量mRNA生成cDNA文庫(kù)；從cDNA中克隆某些基因；生成大量DNA以進(jìn)行序列測(cè)定；突變的分析；染色體步移；RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態(tài)性分析等。一、 試劑準(zhǔn)備DNA模版對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物10xPCRBuffer2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mMTaq酶二、 操作步驟在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。TOC\o"1-5"\h\z10xPCRbuffer 5/dNTPmix(2mM) 4引物1(10pM) 2/引物2(10pM)Taq酶（2U/W）DNA模板（50ng-1pg/pl） 1pl加ddH2O至 50pl視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93°C預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93C40s一58C30s一72C60s，循環(huán)30-35次，最后在72C保溫7min。結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4C待電泳檢測(cè)或-20C長(zhǎng)期保存。PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100pl氯仿進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10pl電泳檢測(cè)。三、PCR反應(yīng)體系的組成與反應(yīng)條件的優(yōu)化PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（10>PCRBuffer）、脫氧核甘三磷酸底物（dNTPmix）、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核甘酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分組成。各個(gè)組份都能影響PCR結(jié)果的好壞。反應(yīng)緩沖液：一般隨TaqDNA聚合酶供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含：50mMKCl，10mMTris-HCl（pH8.3室溫），1.5mMMgCl2。Mg2+的濃度對(duì)反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。在各種單核甘酸濃度為200pM時(shí)，Mg2+為1.5mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物，可適當(dāng)增加Mg2+的濃度。在高濃度DNA及dNTP條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般以1.5-2mM（終濃度）較好。dNTP:高濃度dNTP易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，過高則可能不擴(kuò)增；但濃度過低，將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR中常用終濃度為50-400pM的dNTP。四種脫氧三磷酸核甘酸的濃度應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)誘發(fā)聚合酶的錯(cuò)誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的Mg2+濃度。TaqDNA聚合酶酶：在100pl反應(yīng)體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達(dá)到每min延伸1000-4000個(gè)核甘酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對(duì)PCR反應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當(dāng)作預(yù)試驗(yàn)或使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時(shí)（如20pl或50pl），一般酶的用量仍不小于2U，否則反應(yīng)效率將降低。引物：引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下幾條原則：⑴引物的長(zhǎng)度以15-30bp為宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55C[Tm=4（G+C）+2（A+T）]。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌吟或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機(jī)的。⑵引物的3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物在T端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)少于5個(gè)，引物自身配對(duì)若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)數(shù)不能超過3個(gè)由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，現(xiàn)常常利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。⑶人工合成的寡聚核甘酸引物需經(jīng)PAGE或離子交換HPLC進(jìn)行純化。⑷引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個(gè)弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer）,二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時(shí)，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/W較好。⑸引物一般用TE配制成較高濃度的母液（約100pM），保存于-20°C。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10^M或20^M的工作液。模板：PCR對(duì)模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可作為PCR的樣品。雖然PCR可以用極微量的樣品（甚至是來自單一細(xì)胞的DNA）作為摸板，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般還宜用四水平的基因組DNA或104拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白，將可能干擾PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)加快，即相對(duì)減少變性、復(fù)性、延伸的時(shí)間，可增加產(chǎn)物的特異性。四、注意事項(xiàng)PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。最好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。PCR試劑配制應(yīng)使