抗銀杏二內(nèi)酯葡胺注射液蛋白的單克隆抗體的制備

抗銀杏二內(nèi)酯葡胺注射液蛋白的單克隆抗體的制備

銀杏二甲酯葡胺注射液是以銀杏葉為原料的。提取純度后，從銀杏二甲酯（銀杏a、b、k等）中提取有效部位二甲酯（中風(fēng)病經(jīng)絡(luò)粘液和血瘀阻絡(luò)證）。由于中藥注射劑具有生物提取物的特征,在提取的過程中不可避免地帶來一些生物大分子,比如植物蛋白、核酸等。蛋白質(zhì)是抗原性最強的常見物質(zhì),而且相對分子質(zhì)量越大抗原性越強,越容易引起過敏或類過敏反應(yīng)。因此,中藥注射劑引起過敏反應(yīng)的主要原因之一,可能就是中藥材中所含的植物蛋白或有機質(zhì)在人體內(nèi)形成抗原,從而引發(fā)過敏反應(yīng)。目前中藥的質(zhì)量控制方面多以HPLC法為主,但需精密儀器、費時長、不適合大批量樣品的快速測定。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法成本低、速度快、靈敏度高、儀器設(shè)備簡單。張英華等應(yīng)用ELISA法檢測乳鐵蛋白的量,最小檢出量為0.5ng/mL,線性范圍0.8~100ng/mL,與HPLC法相比,具有快速、簡便、可同時檢測幾十個甚至幾百個試樣的優(yōu)點。江榮炎等通過間接ELISA法檢測正常大鼠不同水代謝狀態(tài)下尿液中水通道蛋白-2。韓素桂等以ELISA法檢測甲胎蛋白異質(zhì)體的量,進而判斷其在原發(fā)性肝癌中的診斷價值。為了檢測并控制過敏原的量,降低其臨床應(yīng)用的風(fēng)險,本研究根據(jù)銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液的制備工藝,以潛在的過敏原即水溶性蛋白的肽段作為免疫原,制備抗銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液蛋白的單克隆抗體,為建立檢測殘留蛋白的ELISA方法奠定基礎(chǔ)。1實驗動物和試劑小型垂直板電泳槽、PowerPaceBasic基礎(chǔ)電源、小型Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽、PROTEANIEFCell等電聚焦儀、17cm聚焦盤和水化盤、PDQuest8.1圖像分析軟件,Bio-Rad公司;超低溫冰箱(-70℃),REVCO公司;Centrifuge5804R高速冷凍離心機,Eppendorf公司;LD4—2A臺式低速離心機,湘儀離心機公司;PowerLook2100XL掃描儀,美國MMAX公司;InfiniteM200Pro酶標儀,TECAN公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱,Thermo公司;超聲波破碎儀,寧波新芝科學(xué)儀器廠;SW—CJ—2F型醫(yī)用凈化工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)公司;ND1000超微量核酸蛋白測定儀,美國NanoDrop公司;WH—861旋渦混合器、WD—9405B水平搖床均為北京六一儀器廠產(chǎn)品。雌性BALB/c小鼠5只,體質(zhì)量18~20g,揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供,許可證號:SCXK(蘇)2007-0001,實驗動物質(zhì)量合格證號:NO0010638。銀杏葉購自主產(chǎn)地山東郯城,經(jīng)江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司質(zhì)量部徐匯工程師鑒定為銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的干燥葉。小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室提供。次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)、次黃嘌呤氨基碟呤和胸腺嘧啶核苷(HAT)、L-谷氨酰胺、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠IgG、堿性磷酸酶(AP)標記的羊抗鼠IgG、50%聚乙二醇,美國Sigma公司;含高糖的DMEM培養(yǎng)基,GIBCO公司;免疫球蛋白標準亞類快速鑒定試劑盒,Thermo公司;蛋白酶抑制劑,羅氏公司;尿素(urea)、硫脲(thiourea)、三羥甲基氨基甲烷(trisbase)、丙烯酰胺(acrylamide)、亞甲基甲叉雙丙烯酰胺(methylenebisacrylamide)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸(glycine),AmershamPharmacia公司;二硫蘇糖醇(DTT)、低溶點瓊脂糖(agarose)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、硝酸銀(AgNO3),Sigma公司;3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-1-丙磺酸(CHAPS)、三正丁基膦(TBP)、兩性電解質(zhì)(ampholyteBio-LytePh3-10)、碘乙酰胺(iodoacetamide)、考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250、溴酚藍(bromophenolblue)、礦物油、固定化pH梯度(IPG)干膠條,Bio-Rad公司;標準蛋白質(zhì)(Marker)、預(yù)染Marker、5×SDS凝膠上樣緩沖液,Fermentas(MBI)公司;堿性磷酸酶顯色試劑盒(BCIP/NBTSolution)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB),AMERSCO公司;2-巰基乙醇、三氯乙酸(TCA)、丙酮、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100),國產(chǎn)分析純。2方法和結(jié)果2.1蛋白質(zhì)量的提取將-70℃保存的銀杏葉剪碎,加入適量液氮研磨成粉末狀;取研磨好的銀杏粉末,每0.1g加入1.5mL的10%TCA-丙酮,-20℃2h后,4℃、12000r/min,離心1h;棄掉上清,重復(fù)1次。加入1.5mL冰浴丙酮,-20℃2h,重復(fù)此操作直到上清變?yōu)榍辶?4℃離心棄掉上清,沉淀置于通風(fēng)廚中風(fēng)干,-70℃保存。取含蛋白沉淀的粉末,水化液裂解樣品:每0.1g加入1mL水化液。水化液配制:1mL水化液中加6μL蛋白酶抑制劑,6μL兩性電解質(zhì)及9mgDTT。先超聲波破碎:30W,間隔5s破碎1次,每次4min;每份再分別加5μL蛋白酶抑制劑,冰浴振搖2h,4℃、12000r/min,離心1h,取上清。以Bradford方法進行蛋白定量,提取蛋白質(zhì)量濃度在7.4mg/mL左右。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)電泳:取水化液裂解的上清,分別加入5×SDS凝膠上樣緩沖液混勻,煮沸5min;每孔上樣35μL,80V20min,120V80min進行總蛋白的分離。結(jié)果見圖1,在相對分子質(zhì)量14400~116000能觀察到較多清晰的條帶。2.2-de電泳2次二維電泳(2-DE):采用17cm、pH5~8的IPG膠條,將水化液裂解的總蛋白上樣,上樣量分別為200、300μg,用水化液稀釋到總體積為300μL。聚焦結(jié)束后取出IPG膠條,進行膠條平衡和第2向凝膠電泳。起始電流為10mA,待樣品完全走出IPG膠條,再加大電流至20~30mA,當溴酚藍指示劑到底部邊緣時即可停止電泳。參照Candiano介紹的膠體考染方法進行考染。2次2-DE圖見圖2。第1次2-DE蛋白上樣量為200μg,由圖2-A可知量較高的點偏少。將2次2-DE以掃描儀掃描,光學(xué)分辨率設(shè)置為600dpi進行透射掃描,數(shù)字化圖象文件運用PDQuest2DAnalysis(Version8.1)軟件進行一系列操作分析。取相關(guān)蛋白點,由廣州慧晶生物公司進行質(zhì)譜分析。根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果(圖3),選取第1次2-DE所取蛋白點(圖2中橢圓圈標示處)中的部分肽段(LRLEDLRIPPAYSKTFQ)進行多肽合成,-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訢NAStar軟件分析得出此肽段抗原指數(shù)為0.3-0.6-0.3-0.75-0.75-1.15-0.93-0.86-1.49-1.92-2.8-1.52-1.24-0.96-1.28-1;親水指數(shù)最高1.43。2.3elisa法篩選模型選取6周齡雌性BALB/c小鼠,用多肽與弗氏佐劑乳化溶液腹腔免疫注射,間隔14d1次,免疫3次,免疫劑量為50μg/只;融合前加強免疫為100μg/只。取效價好的小鼠進行加強免疫,72~96h后取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合。建立多肽為免疫原的間接ELISA法篩選方法,用1μg多肽/孔包被進口酶標板、37℃水浴2h包被。經(jīng)過篩選、有限稀釋法進行多次克隆后,篩選到5株效價與特異性均較好的單克隆細胞株,分別命名為抗銀杏葉蛋白單抗-1d6、1e7、5h9、6h9、6e10。2.4western-blctting檢測采用Thermo公司的免疫球蛋白標準亞類快速鑒定試劑盒對單抗亞類進行鑒定。結(jié)果抗銀杏葉蛋白單抗-1d6、1e7、5h9、6h9、6e10的亞類均為IgM,輕鏈類型均為Kappa鏈。Western-blotting分析:先將銀杏葉總蛋白上樣進行電泳,結(jié)束后,將凝膠切割,在轉(zhuǎn)移緩沖液中按50V2.5h進行轉(zhuǎn)移,然后分別與各單抗的細胞上清進行印記分析。結(jié)果見圖4,表明5株抗銀杏葉蛋白單克隆抗體反應(yīng)性好。3小鼠免疫中多態(tài)性細胞的表達銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液處方只含銀杏葉一種藥材,根據(jù)其制備工藝可知,制劑中如有殘留蛋白應(yīng)該為水溶性蛋白。從SDS結(jié)果可以看出,TCA-丙酮法提取的蛋白種類較多,想得到純度高的蛋白難度很大。第1次2-DE上樣量低、豐度高的蛋白點偏少,但是若有殘留蛋白,則濃度高的蛋白可能性更大,因此加大總蛋白上樣量,在2次2-DE后,取相關(guān)蛋白點進行質(zhì)譜分析,經(jīng)過DNAStar軟件分析并進行比較后合成抗原性及水溶性較好的多肽用于小鼠免疫。自從1975年Kohler和Milstein首創(chuàng)淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體以來,該技術(shù)作為一種成熟的常規(guī)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)的各個領(lǐng)域。然而,要獲得高質(zhì)量的單抗并非易事,抗原質(zhì)量、免疫程序、篩選方法等諸多因素均與單抗的質(zhì)量有關(guān)。本實驗經(jīng)過2次細胞融合,第1次融合篩選到的陽性孔在第1次克隆之后轉(zhuǎn)為陰性,應(yīng)該是雜交瘤細胞中陰性細胞較多且生長過快,從而抑制了陽性細胞的生長。