不同原料中的六氫過氧化物裂解酶提取工藝研究

不同原料中的六氫過氧化物裂解酶提取工藝研究

植物氫氧化分解酶（hpl）是植物脂氧化過程中由脂氧合酶（lox）下游的酶。這些酶可由脂肪氧化酶和多甲基脂肪酸組成的氫過氧化脂肪酸分解而成。它是植物產(chǎn)生清香風味成分基本途徑(LOX/HPL)的關(guān)鍵組成部分之一,且其催化產(chǎn)物還與植物抗病、抗蟲害有關(guān)。近年來由于人們對天然香料的青睞,氫過氧化物裂解酶也逐漸受到人們的關(guān)注。本課題對不同植物中氫過氧化物裂解酶含量進行比較和篩選,并選擇莧菜氫過氧化物裂解酶為研究對象進行初步分離純化和性質(zhì)研究。本研究為酶法生產(chǎn)C6揮發(fā)性醛類奠定堅實的基礎(chǔ)。這是首次從中國種植莧菜中分離純化得到氫過氧化物裂解酶。1材料和方法1.1-blox、脂肪酸、亞麻酸、己烯醛、己烯醛等青椒、莧菜、茄子、豌豆苗、菠菜和綠豆芽均購于當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。二硫蘇糖醇(DTT)、大豆脂肪氧合酶typeⅠ-B(LOX)、亞油酸、亞麻酸、己醛、己烯醛均購于Sigma公司。其他試劑為分析純。CXG-I型電腦恒溫層析柜、HL-2型恒流泵、BS2-100型自動部分收集器,上海滬西設(shè)備廠;羥基磷石灰柱填料,上海Bio-red公司;DEAE-Tog-opeval柱頂料,上海TOSOH公司;柱套、上海錦華層析設(shè)備廠。1.2實驗方法1.2.1lox-硼酸鹽緩沖液的制備100mg亞麻酸或亞油酸溶于2mL無水乙醇中,后轉(zhuǎn)移至預先通氧氣至飽和的100mL0.2mol/LpH9.0的硼酸鹽緩沖液中,隨后加入3mg溶入少量的硼酸鹽緩沖液的LOX?？焖贁嚢杈鶆蚝笤诒『统掷m(xù)通氧條件下反應1.5h,隨后用6mol/LHCl調(diào)節(jié)反應液至pH3.0以下結(jié)束反應。用等體積無水乙醚萃取反應液2次后合并有機相,加入無水MgSO4干燥,過濾后在30℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚,殘留部分為亞麻酸氫過氧化物(13-HPOT)或亞油酸氫過氧化物(13-HPOD)溶于一定量乙醇,充氮后分裝于-20℃下密封保存。1.2.2氫過氧化物裂解酶鹽析100g不同原料(青椒去籽去蒂、茄子去心去籽、綠豆芽子葉、豌豆苗葉、菠菜葉、莧菜葉)與300mL0.1mol/LpH6.8的Tris-HCl(含0.5%PVP),勻漿3次共1min得粗均漿液。4層紗布過濾,濾液于30000g、4℃離心20min,棄去上清液,沉淀為氫過氧化物裂解酶(HPL)膜組分。而后用50mL含0.5%Triton-X100的0.1mol/LpH8.5的Tris-HCl(和5mmol/LDTT)溶解沉淀,4℃下攪拌1h,在30000g、4℃下離心20min,上清液即為溶解膜組分待用。1.2.3線性下降檢驗采用分光光度法測定氫過氧化物裂解酶(HPL)的酶活。取xμL酶液(15～40μL,因原料不同而不同)和15μL10mmol/L底物(13-HPOD或13-HPOT)與合適pH下的(2985-x)μL0.02酸鹽緩沖液混合,在234nm、1min內(nèi)測定其吸光值的線性下降?？瞻子脁μL酶液和(3000-x)μL磷酸鹽緩沖液混合。1U酶活定義為每分鐘每裂解1μmol/L13-HPOD/13-HPOT所需的酶量(ε=25000mol/(L·cm).1.2.4測定蛋白質(zhì)含量的測定采用的BCA法測定。1.2.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制所用的緩沖液為pH5.0的0.02mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液,pH6.0、pH7.0、pH8.0的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液,pH9.0的0.02mol/L硼酸鹽緩沖液。1.2.6tritronx-100微生物濾膜的制備莧菜經(jīng)1.2.2所述處理后經(jīng)硫酸銨分級沉淀(5%～35%飽和度)再于40000g、4℃下離心30min得沉淀,用少量0.01mol/L,pH6.8的磷酸鈉緩沖液(其中含1mmol/LDTT和0.5%TritronX-100(緩沖液A))溶解后在相同緩沖液中透析過夜,在40000g、4℃下離心30min,取上清液過0.22μm微孔濾膜。過膜后酶液上經(jīng)緩沖液A平衡過的羥基磷灰石柱(2.6cm×15cm),用含0.01、0.25和0.4mol/L磷酸鈉的緩沖液A進行階段洗脫,流速為3.0mL/min,收集有酶活部分,用35%硫酸銨沉淀,離心,倒掉上清液,用少量0.02mol/L,pH8.5的Tris-HCl緩沖液(其中含1mmol/LDTT和0.5%TritronX-100(緩沖液B))溶解,再在緩沖液B中透析過夜。將透析液離心后,去上清,上經(jīng)緩沖液B平衡的DEAE-Toyopearl柱((1.1cm×8.0cm),用含0,0.15,0.25和1.0mol/LNaCl的緩沖液B進行階段洗脫,流速為1.0mL/min,收集有酶活部分,用100ku的超濾管濃縮(15mL,Millipore,上海,中國)待用。1.2.7聚丙烯酰胺終濃度對蛋白的影響依照Laemmli進行純化HPL樣品的十二烷基硫酸鈉凝膠電泳(SDS)。分離膠和濃縮膠的聚丙烯酰胺終濃度分別為12%(w/v)和4%(w/v)。蛋白用考馬斯亮藍染色。標準分子量蛋白為:兔磷酸化酶b(97400u),牛血清白蛋白(66200u),兔肌動蛋白(43000u),牛碳酸酐(31000u),胰蛋白酶抑制劑(20100u)和雞蛋清溶菌(14400u)。1.2.8hpl殘留活性的測定將粗酶液與0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液的反應體系,分別在25、30、35、40、45、50℃以及55℃水浴中保溫一定時間后立即冰浴冷卻至室溫后,測定HPL的殘留活性。2結(jié)果與討論2.1ph的適應性為了更準確地比較不同原料中HPL的酶活,先對其最適pH值進行了測定。由表1可以看出,幾種原料的最適pH值在5.5～7.0,且對于13-HPOD和13-HPOT其最適pH基本相同;而據(jù)報道,梨、茶葉和大豆子葉中最適pH都在中性。不同來源的HPL對pH的敏感程度不同。青椒、莧菜HPL的最適pH在6.0附近,對pH的上升較敏感;而豌豆苗和菠菜最適pH在7.0左右,且對pH下降比較敏感。茄子HPL在pH值6.0～8.0酶活能夠維持在90%以上,在pH5.0時大約為80%,在pH9.0時仍能維持在60%以上,說明茄子HPL有著一個較寬的工作pH。2.2hpl的底物選擇性根據(jù)表1,在不同來源HPL的最適pH下分別測定其活力,結(jié)果見圖1。莧菜HPL的活性顯著高于其他被選原料。因此選用莧菜葉作為原料提取HPL。由圖1可知,所選原料中HPL對13-HPOT的活力更高。與Fauconnier等人和Shibata等人發(fā)現(xiàn)番茄和青椒中的HPL也有類似的底物特異性的報道相吻合。然而,Olias等人報道,在大豆幼苗中,HPL對13-HPOD的特異性高于13-HPOT。據(jù)報道,酶的特異性與生物體內(nèi)真實脂肪酸組成是一致的。在莧菜葉中,亞麻酸是主要脂肪酸(占42%),這符合HPL的底物特異性。相類似的亞麻酸在青椒中尤為豐富,而亞油酸是在大豆幼苗中占有優(yōu)勢。2.3羥基磷灰石柱的純化莧菜葉經(jīng)均漿,高速離心,表面活性劑溶解和硫酸銨沉淀得到部分純化HPL,具體結(jié)果見表2。通過高速離心得到膜組分回收了莧菜葉粗均漿液中絕大部分的HPL,而0.5%TritonX-100能將HPL從膜組分上溶解和分離,比酶活提高1.8倍。隨后通過硫酸銨沉淀對HPL進行進一步純化。經(jīng)硫酸銨沉淀后的HPL粗酶液上羥基磷灰石柱,收集磷酸鹽濃度為0.25mol/L的洗脫峰(見圖2)用硫酸銨進行濃縮,進行下一步分離純化。將經(jīng)羥基磷灰石柱層析的酶液上DEAEToyopearl柱,結(jié)果見圖3。收集活性組分,得到純化倍數(shù)為83.3倍的HPL,酶比活為22.5U/mg,回收率為27%。2.4杏仁氫氧化酶的sdp由圖4可知,經(jīng)過一系列過程的純化,得到電泳純的HPL,在SDSPAGE圖譜上基本為單一條帶條帶,分子質(zhì)量約為55ku,與報道一致。2.5紫菜hpl活性測定由圖5可以看出,莧菜HPL的合適反應溫度為20～35℃,反應最適溫度為25℃。由圖6可知,在10～45℃加熱10min,莧菜HPL活性能維持在80%以上,而高于45℃,隨溫度的上升,酶活迅速下降,在55℃保溫10min后酶活基本完全喪失?？梢奌P