熒光分光光度計法測定麗娃河

熒光分光光度計法測定麗娃河水體中葉綠素實驗報告姓名：畢倩倩學(xué)號：51102601010專業(yè)：海洋化學(xué)指導(dǎo)老師：高磊實驗?zāi)康牧私鉄晒夥止夤舛扔媰x器的原理及用途掌握本實驗葉綠素測定的原理及簡單實驗操作熒光分光光度計儀器組成及原理熒光分光光度計儀器主要由以下5個組成部分：光源：為高壓汞蒸氣燈或氙弧燈，后者能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)光譜，且在300nm?400nm范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，故較常用。>激發(fā)單色器：置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。發(fā)射單色器：置于樣品室和檢測器之間的為發(fā)射單色器或第二單色器，常采用光柵為單色器。篩選出特定的發(fā)射光譜。樣品室：通常由石英池(液體樣品用)或固體樣品架(粉末或片狀樣品)組成。測量液體時，光源與檢測器成直角安排；測量固體時，光源與檢測器成銳角安排。>檢測器：一般用光電管或光電倍增管作檢測器?？蓪⒐庑盘柗糯蟛⑥D(zhuǎn)為電信號。工作原理：由高壓汞燈或氙燈發(fā)出的紫外光和藍(lán)紫光經(jīng)濾光片照射到樣品池中，激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，熒光經(jīng)過濾過和反射后，被光電倍增管所接受，然后以圖或數(shù)字的形式顯示出來。物質(zhì)熒光的產(chǎn)生是由在通常狀況下處于基態(tài)的物質(zhì)分子吸收激發(fā)光后變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)這些處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，在返回基態(tài)的過程中將一部分的能量又以光的形式放出，從而產(chǎn)生熒光。不同物質(zhì)由于分子結(jié)構(gòu)的不同,其激發(fā)態(tài)能級的分布具有各自不同的特征，這種特征反映在熒光上表現(xiàn)為各種物質(zhì)都有其特征熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，因此可以用熒光激發(fā)和發(fā)射光譜的不同來定性地進(jìn)行物質(zhì)的鑒定。在溶液中，當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較低時，其熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度通常有良好的正比關(guān)系，即IF=KC，利用這種關(guān)系可以進(jìn)行熒光物質(zhì)的定量分析。實驗原理在自然水體中，葉綠素存在于浮游植物的細(xì)胞當(dāng)中，其含量能夠反映水體中浮游植物的數(shù)量。水樣采集之后，經(jīng)過過濾，將浮游植物附著在濾膜之上。再經(jīng)過90%丙酮萃取，最后定容，測定萃取液中的葉綠素濃度。本次實驗利用分光光度計來測定葉綠素濃度。它采用430nm的紫外光光源照射葉綠素樣品，從而激發(fā)葉綠素產(chǎn)生熒光，所產(chǎn)生的熒光越強(qiáng)，葉綠素的濃度也越高，二者成線性正相關(guān)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作可得出葉綠素濃度與光強(qiáng)的對應(yīng)關(guān)系。通過這種對應(yīng)關(guān)系確定葉綠素計算公式中的待定系數(shù)。最后根據(jù)葉綠素濃度公式和待測樣品所得出熒光值即可計算出。另外，葉綠素的測定中需要添加酸化步驟。這是因為除了葉綠素以外還有其他物質(zhì)被萃

取到丙酮中，在受到紫外光照射時它們也可能產(chǎn)生熒光。加酸后，可以破壞掉所有的葉綠素，再測定熒光強(qiáng)度，用酸化前的減去酸化后的數(shù)值所得出的即為葉綠素所占的部分。實驗儀器及材料熒光分光光度計(日立F-2500)過濾裝置(含手泵)移液槍5ml、1ml石英皿、擦鏡紙塑料樣品管parafilm膜2張0.7pmwhatmanGF/F膜鑷子量筒麗娃河水500ml丙酮10%HCl溶液實驗步驟(1)用鑷子加入1張0.7pmwhatmanGF/F膜于過濾裝置的濾芯上，擰好白色塑料圈，取250ml麗娃水倒入過濾裝置，用手泵減壓，使水樣通過濾膜過濾，至膜表面干即可。打開白色塑料圈，將過濾好的濾膜折疊好加到塑料樣品管中，且放入底部，加入5ml丙酮，蓋上蓋子，震蕩10-15s，攪拌均勻。用parafilm膜封住蓋口，寫好標(biāo)簽。另在重復(fù)一次操作。結(jié)束后，將樣品管放置在冰箱中冷凍。(2)24h后，將兩個樣品管取出，震蕩10-15s，用Milli-Q水潤洗石英皿3遍，用(2)1ml移液槍去上層清液2ml，用擦鏡紙拭干石英皿表面水，放入儀器的樣品池中，上機(jī)測量。儀器的設(shè)置為:Response:2.0sEMEndML:685nmResponse:2.0sEMEndML:685nmReplicate:3Scanspeed:300nm/mincycletime:0minDelay:20sEX:10nmdatamode:fluorescenceEm:215nmExWL:430nmPMTVoltage:700VEMstartML:660nm測試完，讀取3個數(shù)據(jù)，然后向石英皿中滴加一滴10%HCl溶液，再測量，讀取3個數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果與討論Samplel：酸化前三次數(shù)據(jù)：163.5、160.7、162.3平均值：162.17酸化后三次數(shù)據(jù)：72.66、73.39、72.64平均值：72.90Sample2：酸化前三次數(shù)據(jù)：169.1、169.9、170.2平均值：169.73酸化后三次數(shù)據(jù)：73.82、73.82、72.30平均值：73.31chl-achl-a(ug/L)=x(F-F)xKxx0'Vol}VolXVfilt)其中Fm：酸化比，取Fm=2.2Fo：加酸前3次讀數(shù)平均值Fa：加酸后3次讀數(shù)平均值Kx：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，取Kx=1.9086Volex:萃取體積，取Volex=5.8mlVolfilt：過濾體積，單位與Volex一致，也為ml討論：可以看出兩個平行實驗Sample1和Sample2計算出來的葉綠素的值相差不是很大，平均值為7.537mg/L，計算出來的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%，這可能是由于實驗誤差或者系統(tǒng)誤差導(dǎo)致的。目前水體富營養(yǎng)化一般采用的指標(biāo)是：水體中氮含量超過0.2-0.3ppm，生化需氧量大于10ppm，磷含量大于0.01-0.02ppm，pH值7-9的淡水中細(xì)菌總數(shù)每