microRNA在自身免疫性肝炎中的作用機(jī)制研究進(jìn)展①

microRNA在自身免疫性肝炎中的作用機(jī)制研究進(jìn)展①

趙海霞雒揚(yáng)李汛（蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州730000）自身免疫性肝炎（autoimmunehepatitis，AIH）是一種以轉(zhuǎn)氨酶水平升高、血清自身抗體陽性、高IgG血癥、界面性肝炎和肝組織漿細(xì)胞浸潤為特征的自身免疫介導(dǎo)的慢性肝臟內(nèi)生組織炎癥反應(yīng)［1］。盡管人們已對環(huán)境、遺傳和表觀遺傳因素驅(qū)動(dòng)的肝臟免疫穩(wěn)態(tài)失調(diào)具有廣泛了解，但AIH發(fā)病的潛在分子機(jī)制尚未明確［1］。AIH缺乏特異性診斷指標(biāo)，目前診斷是基于臨床表現(xiàn)、生化檢查、血清免疫學(xué)和組織學(xué)表現(xiàn)的綜合診斷［2］。糖皮質(zhì)激素加硫唑嘌呤是AIH的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但僅對70%～80%患者有效，且常見藥物副作用及不良反應(yīng)［1］。AIH未經(jīng)及時(shí)診斷和有效治療可迅速發(fā)展為肝衰竭、肝硬化甚至肝癌［3-4］。因此，闡明AIH的發(fā)病機(jī)制、尋找AIH的特異性標(biāo)志物及新型治療策略具有重要意義。miRNA具有廣泛調(diào)控作用，可潛在調(diào)節(jié)細(xì)胞各方面生物功能，在多種自身免疫性疾病中起關(guān)鍵作用，miRNA失調(diào)通常影響疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后［5］。miRNA與炎癥相關(guān)通路的相互作用參與AIH發(fā)生發(fā)展，可作為AIH新的治療靶點(diǎn)，并進(jìn)一步證實(shí)miRNA也可成為AIH的生物標(biāo)志物。故本文將miRNA對AIH的調(diào)控作用及其在AIH診斷、治療方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。1miRNA概述miRNA是動(dòng)、植物和某些病毒中發(fā)現(xiàn)的一類短小非編碼RNA。1993年在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNAlin-4，2000年發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)人類miRNAlet-7，目前miRNA數(shù)據(jù)庫中標(biāo)注了2000多種人類成熟miRNA［6］。miRNA是一種內(nèi)源性、進(jìn)化高度保守的單鏈RNA，其長度約為22個(gè)核苷酸，可通過與靶mRNA互補(bǔ)序列結(jié)合干擾蛋白產(chǎn)生［7］。除翻譯抑制外，miRNA還可吸引和招募mRNA限制因子，導(dǎo)致mRNA降解和基因表達(dá)中斷，從而在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控目的基因表達(dá)［8］。人體內(nèi)1/3左右基因在不同程度均受到miRNA調(diào)控，每個(gè)miRNA可調(diào)控?cái)?shù)個(gè)靶基因，而同一個(gè)靶基因也可被多個(gè)miRNA調(diào)控［9-10］。因此miRNA對靶基因表達(dá)的調(diào)控作用在人類基因組中構(gòu)成了一個(gè)龐大而復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在各種生物過程中發(fā)揮重要作用。2miRNA生物合成2.1經(jīng)典途徑初級miRNA（primarymiRNA，primiRNA）是一種具有5＇端m7GpppN帽子結(jié)構(gòu)和3＇端多聚腺苷酸尾并折疊形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長達(dá)幾百個(gè)堿基對的可變轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在細(xì)胞核中由獨(dú)立基因或編碼蛋白質(zhì)的DNA序列內(nèi)含子經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ（RNApolymerseⅡ，RNApolⅡ）轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的pri-miRNA在細(xì)胞核中通過與包含RNA內(nèi)切酶ⅢDrosha及其輔助因子DGCR8組成的微處理器復(fù)合物相互作用，被修飾為長度60～200個(gè)核苷酸的前體miRNA（precursormiRNA，pre-miRNA），pre-miRNA通過GTP依賴的核質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin5（RanGTP/exportin-5）復(fù)合物將其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中再由另一種RNA內(nèi)切酶ⅢDicer及其伴侶蛋白反式激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白（transactivationresponseRNA-bindingprotein，TRBP）將premiRNA末端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)剪切后產(chǎn)生長度約為22個(gè)核苷酸的miRNA雙鏈體［11-12］。miRNA雙鏈體中的引導(dǎo)鏈成為最終成熟的miRNA，參與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）形成，該復(fù)合體是促進(jìn)特定miRNA與靶向mRNA結(jié)合的關(guān)鍵因子，其隨從鏈因結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定將被降解［13-14］。2.2非經(jīng)典途徑非經(jīng)典途徑即miRNA生物合成的替代途徑，經(jīng)替代途徑合成的幾種不同類別RNA在結(jié)構(gòu)和功能上與miRNA相似，但繞過了miRNA經(jīng)典生物合成途徑中的一個(gè)或多個(gè)步驟。經(jīng)典途徑中，Drosha和DGCR8是miRNA合成是必不可少的。因此，不依賴于Drosha和DGCR8合成miRNA的途徑被認(rèn)為是miRNA合成的非經(jīng)典途徑。非經(jīng)典途徑中，某些脫支內(nèi)含子可被剪接體加工成套索狀“mirtrons”，被套索狀的脫支酶裂解，折疊為premiRNA發(fā)夾，隨后，這種pre-miRNA同樣通過RanGTP/exportin-5復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，以經(jīng)典途徑繼續(xù)進(jìn)行miRNA合成［15］。miRNA的生物合成過程如圖1所示。圖1miRNA生物合成Fig.1BiogenesisofmiRNA3miRNA在AIH中的調(diào)控作用3.1miRNA對AIH患者肝臟Kupffer細(xì)胞（Kupffercells，KCs）的調(diào)控作用巨噬細(xì)胞在生理和病理狀態(tài)下對維持肝臟免疫穩(wěn)態(tài)起主導(dǎo)作用，在信號分子作用下具有非?？焖俚谋硇秃凸δ茏兓芰?，可根據(jù)肝臟組織微環(huán)境需要活化為M1表型或M2表型。M1型巨噬細(xì)胞以分泌促炎因子和趨化因子為主，參與正向免疫應(yīng)答，M2型則通過分泌抗炎因子負(fù)調(diào)控免疫應(yīng)答，發(fā)揮組織修復(fù)功能［16］。KCs是具有自我更新能力的肝內(nèi)常駐巨噬細(xì)胞，通過產(chǎn)生促炎因子、將抗原提呈給T細(xì)胞并與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞協(xié)同啟動(dòng)竇內(nèi)血栓形成參與AIH發(fā)?。?7-18］。miRNA在不同炎癥反應(yīng)中對巨噬細(xì)胞發(fā)育、活化等生物學(xué)過程具有重要調(diào)節(jié)作用［19］。YANG等［20］發(fā)現(xiàn)在刀豆蛋白A（concanavalinA，ConA）誘導(dǎo)的小鼠肝損傷早期，KCs中miR-223水平顯著降低，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-223通過負(fù)調(diào)控KCs中黑色素瘤缺失因子2（absentinmelanoma2，AIM2）表達(dá)減少促炎因子IL-1β分泌。其次，miR-223是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemesenchymalstemcells，BMSCs）中表達(dá)最高的miRNA，尤其在BMSCs來源的外泌體中高表達(dá)，通過抑制炎癥小體NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-likereceptorpyrindomaincontaining3，NLRP3）活化抑制NLRP3/caspase-1信號通路激活，減少IL-1β成熟和分泌、誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞焦亡，顯著逆轉(zhuǎn)小鼠AIH肝損傷［21］。表明miR-223通過調(diào)節(jié)KCs功能在AIH發(fā)病機(jī)制中起重要作用，且可能成為治療AIH的新靶點(diǎn)之一。此外，ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷過程中，KCs中miR-375高表達(dá)，與促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)呈正相關(guān)，而與星形細(xì)胞上調(diào)基因-1（astrocyte-elevatedgene-1，AEG-1）表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，功能研究證實(shí)miR-375抑制劑通過直接靶向調(diào)控AEG-1表達(dá)減少KCs凋亡，從而恢復(fù)肝臟免疫穩(wěn)態(tài)［22］。同樣，另一項(xiàng)類似研究觀察到，KCs中miR-138表達(dá)上調(diào)且可通過靶向負(fù)調(diào)控P53基因表達(dá)增加促炎因子釋放，轉(zhuǎn)染miR-138抑制劑后小鼠肝功能得到明顯改善［23］。3.2miRNA對AIH患者T細(xì)胞的調(diào)控作用CD4+T細(xì)胞活化介導(dǎo)AIH肝損傷已得到證實(shí)，Treg免疫調(diào)節(jié)受損和Th17細(xì)胞分化增加在AIH發(fā)生發(fā)展過程中起核心作用，Treg/Th17平衡與AIH疾病嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)［24］。已發(fā)現(xiàn)多種miRNA通過調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡參與AIH肝臟炎癥反應(yīng)。ZHAO等［25］通過構(gòu)建miR-7基因敲除模型首次發(fā)現(xiàn)miR-7缺失加劇ConA誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷，miR-7缺失的AIH小鼠肝組織中促凋亡蛋白Bad、Bax和p53表達(dá)顯著增加、CD4+T細(xì)胞比例急劇上升，且miR-7通過靶向絲裂原活化蛋白激酶4（mitogen-activatedproteinkinases4，MAPK4）部分負(fù)調(diào)控CD4+T細(xì)胞活化和功能，而轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT/enhancerbindingprotein-α，C/EBPα）可通過與miR-7b基因核心啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞miR-7表達(dá)，提示C/EBPα/miR-7軸在CD4+T細(xì)胞中對免疫性肝損傷發(fā)揮重要作用。miR-15a/16-1是一種腫瘤抑制因子，但最近研究表明，其在生理和病理?xiàng)l件下均可作為免疫調(diào)節(jié)劑影響巨噬細(xì)胞吞噬作用、NK細(xì)胞成熟及T細(xì)胞活化［26］。AIH小鼠模型中，miR-15a/16-1表達(dá)下調(diào)，與IL-22表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，敲除miR-15a/16-1后小鼠肝組織局部具有較高水平的IL-22分泌，且血清轉(zhuǎn)氨酶水平下降，肝臟炎癥浸潤減輕，表明miR-15a/16-1以IL-22依賴方式改善肝損傷，進(jìn)一步研究顯示，CD4+T細(xì)胞是肝損傷期間IL-22的主要來源，而芳基烴受體（arylhydrocarbonreceptor，AHR）是CD4+T細(xì)胞miR-15a/16-1的直接靶標(biāo)，敲除CD4+T細(xì)胞的miR-15a/16-1通過上調(diào)AHR表達(dá)產(chǎn)生更多的IL-22，而IL-22通過激活pSTAT3-c-myc信號通路進(jìn)一步下調(diào)受損肝細(xì)胞中miR-15a/16-1表達(dá)，可見miR-15a/16-1類似“剎車分子”，通過調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞IL-22分泌介導(dǎo)AIH肝損傷修復(fù)［27］。ZHANG等［28］發(fā)現(xiàn)，miR-let-7a通過下調(diào)IL-6分泌負(fù)調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化，對免疫性肝損傷具有顯著治療作用。IL-6是經(jīng)典炎癥細(xì)胞因子，不僅可抑制TGF-β誘導(dǎo)的Treg分化，還通過誘導(dǎo)維甲酸相關(guān)孤核受體γt（retinoid-relatedorphanreceptorgammat，RORγt）表達(dá)促進(jìn)Th17細(xì)胞分化［29］。而let-7a通過負(fù)調(diào)節(jié)IL-6分泌抑制Th17細(xì)胞分化，因此miR-let-7a/IL-6信號通路可能成為AIH的另一潛在治療靶點(diǎn)。miR-155是與免疫調(diào)控關(guān)系最為密切的miRNA之一，分布廣泛，且具有多靶基因特性，miR-155表達(dá)或功能異常參與多種肝臟疾病發(fā)生發(fā)展［30］。miR-155也是AIH發(fā)病的研究熱點(diǎn)之一。與野生型AIH小鼠相比，miR-155-/-AIH小鼠注射ConA后轉(zhuǎn)氨酶和促炎因子IFN-r、TNF-α水平明顯升高，肝臟炎癥及壞死嚴(yán)重程度提高，敲除miRNA-155基因通過直接靶向負(fù)調(diào)控SHIP1表達(dá)導(dǎo)致Treg數(shù)減少且在肝臟中募集受損，維持炎癥細(xì)胞中miR-155正常表達(dá)對AIH肝損傷具有保護(hù)作用［31］。但另外一項(xiàng)研究則得出相反結(jié)論，miR-155抑制劑通過減少炎癥細(xì)胞浸潤、恢復(fù)破壞的肝臟結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)Treg/Th17失衡顯著改善ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷［32］。此外，還有研究報(bào)道，miR-155主要在AIH患者肝臟門脈區(qū)CD4+T細(xì)胞中高表達(dá)，可能通過調(diào)節(jié)Treg/Th1平衡參與AIH發(fā)?。?3］?？梢妋iR-155的多靶基因特性使其在炎癥細(xì)胞募集和肝臟損傷過程中可能具有不同作用，原因可能為其介導(dǎo)的基因表達(dá)在AIH不同發(fā)病階段產(chǎn)生的效果不一。另外一項(xiàng)評估攜帶miR-223的外泌體對AIH治療作用的研究發(fā)現(xiàn)，miR-223能夠調(diào)節(jié)AIH小鼠模型肝內(nèi)IL-1β和IL-6表達(dá)、抑制Th17細(xì)胞分化、改變肝臟和脾臟中Treg和Th17細(xì)胞比例，抑制病情發(fā)展，提示外泌體由于其較弱的毒性、免疫原性和較低的不良反應(yīng)，可作為外源性miRNA治療AIH的生物載體［34］。3.3miRNA對AIH脂質(zhì)代謝和纖維化的調(diào)控作用半胱氨酰白三烯（cysteinylleukotrienes，CysLTs）是花生四烯酸（arachidonicacid，AA）的代謝產(chǎn)物，是一種普遍存在的炎癥遞質(zhì)，參與調(diào)節(jié)AIH炎癥反應(yīng)，可通過增加鈣內(nèi)流引起毛細(xì)血管收縮或減少谷胱甘肽耗竭加重肝損傷。ConA誘導(dǎo)的肝損傷早期，AA代謝的關(guān)鍵酶5-脂氧化酶（5-lipoxygenase，5-LO）過表達(dá)，CysLTs釋放增加，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-674-5p對肝細(xì)胞AA/5-LO代謝途徑具有負(fù)調(diào)控作用，可減輕CysLTs介導(dǎo)的肝損傷［35］。miR-143已被證明可調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)、抑制TGF-β依賴性細(xì)胞外基質(zhì)積聚和平滑肌細(xì)胞纖維化。miR-143-3p可通過抑制TGF-β活化激酶1（transforminggrowthfactor-beta-activatedkinase1，TAK1）磷酸化減輕肝臟炎癥反應(yīng)和纖維化［36］。miR-193a/b-3p可抑制Ⅰ型膠原α1鏈（COL1A1）和α-SMA表達(dá)及TGF-β/Smad2/3信號通路激活，在小鼠體內(nèi)將其過表達(dá)可減輕ConA誘導(dǎo)的肝損傷，且可抑制膠原沉積、降低結(jié)蛋白和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)、降低肝組織中羥脯氨酸、TGF-β1和活化素A含量，對AIH肝纖維化起抑制作用［37］。多項(xiàng)研究證實(shí)miRNA在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中具有重要調(diào)節(jié)作用，但目前針對AIH肝纖維化相關(guān)miRNA的研究較少，以上研究為miRNA參與調(diào)節(jié)AIH相關(guān)肝纖維化提供了有力支持。miRNA在AIH中的調(diào)控作用如圖2所示。miRNA在AIH中的作用機(jī)制見表1。表1miRNA在AIH中的作用機(jī)制Tab.1MechanismofmiRNAinAIH圖2miRNA在AIH中的調(diào)控作用Fig.2RegulatoryroleofmiRNAinAIH4miRNA是AIH潛在的生物標(biāo)志物2015年MIGITA等［38］首次篩選出了46位1型AIH患者血清中差異表達(dá)的miRNA，并將其與慢性丙型肝炎患者和健康人群進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AIH患者循環(huán)中miR-21水平顯著高于慢性丙肝患者和正常人，且血清miR-21和miR-122水平與血清ALT水平呈正相關(guān)，miR-21也與AIH肝臟炎癥組織學(xué)分級相關(guān)，糖皮質(zhì)激素治療后miR-21和miR-122水平大大降低，初步證明miR-21和miR-122可作為AIH疾病嚴(yán)重程度和治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，AIH患者肝臟中miR-155表達(dá)上調(diào)，但在外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs）中表達(dá)下調(diào)［31］。KATSUSHIMA等［39］研究表明，與健康人群相比，AIH患者PBMCs中miR-132和miR-99a表達(dá)顯著升高，而miR-299-5p表達(dá)下降。崔海霞等［40］發(fā)現(xiàn)AIH患兒PBMCs中miR-181c表達(dá)下調(diào)。提示miRNA可作為AIH的診斷指標(biāo)。miR-122是一種腫瘤抑制因子，可調(diào)節(jié)肝臟膽固醇和脂肪酸代謝及鐵穩(wěn)態(tài)，在多種肝臟疾病中循環(huán)miR-122水平升高，或許可作為慢性丙型肝炎的生物標(biāo)志物，且敏感性和特異性較高［41］。而miR-21由淋巴細(xì)胞表達(dá)，一方面可通過下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)蛋白8樣因子2（tumornecrosisfactor-αinducedprotein-8-like-2，TIPE2）產(chǎn)生促進(jìn)Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，另一方面可阻礙程序性細(xì)胞死亡因子4（programmedcelldeath4，PDCD4）蛋白產(chǎn)生，PDCD4可激活NF-κB，抑制抗炎因子IL-10分泌，因此miR-21可能調(diào)節(jié)PDCD4在AIH中的促炎效應(yīng)和促凋亡活性，也可成為AIH的另一潛在干預(yù)靶點(diǎn)［42］。miRNA能否作為AIH治療生物標(biāo)志物主要取決于其器官特異性和致病性。肝臟特異性miRNA作為AIH的生物標(biāo)志物是有效的，可作為預(yù)測常規(guī)免疫抑制治療無反應(yīng)、停藥后復(fù)發(fā)或進(jìn)展為肝硬化的指標(biāo)進(jìn)一步評估AIM。miR-122具有肝臟特異性，但其生物學(xué)意義尚未確定，miR-21與AIH的生物學(xué)相關(guān)性也有不同結(jié)果，停留在推測階段［42］。5潛在的AIH相關(guān)miRNA國外學(xué)者采用微陣列技術(shù)分析了4例初治AIH患者和4例健康人肝臟活檢標(biāo)本中miRNA和mRNA的差異表達(dá)譜，結(jié)果顯示，AIH患者肝組織中15個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，8個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)（表2），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)大部分差異表達(dá)基因?yàn)槊庖邞?yīng)答相關(guān)基因，如Th1細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)基因CXCL9/10/11、CXCR3、IFN-γ、T-bet，Treg應(yīng)答相關(guān)基因CTLA4、FOXP3、PD-1、BTLA等［33］。此外，幾項(xiàng)研究通過分析不同AIH小鼠模型和健康小鼠肝組織miRNA表達(dá)，篩選出