DB15T+3170-2023籽用西葫蘆種子病毒RT-PCR檢測技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01CCSICS65.020.01CCSB21內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標準DB15/T3170—2023RT-PCRTechnicalcodeofpracticeforRT-PCRdetectionofseed-usedpumpkin(CucurbitapepoL.)seedvirus2023-09-152023-09-152023-10-15內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。（SAM/TC25）本文件主要起草人：王萍、劉杰才、陳貴華、許珂、尚鵬、李石恒、畢曉宇。籽用西葫蘆種子病毒RT-PCR檢測技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了籽用西葫蘆種子病毒RT-PCR檢測技術(shù)中涉及的試劑與材料、儀器和設(shè)備、對照設(shè)置、樣品采集、樣品病毒檢測、結(jié)果分析與表述。（Cucumbermosaicvirus，CMV）（Watermelonmosaic（Zucchiniyellowmosaic的RT-PCR本文件沒有規(guī)范性引用文件。下列術(shù)語和定義適用于本文件。黃瓜花葉病毒cucumbermosaicvirus，CMVCMV西瓜花葉病毒watermelonmosaicvirus,WMV（WMV）（Potyviridae）（Potyvirus），在自然小西葫蘆黃化花葉病毒zucchiniyellowmosaicvirus，ZYMV1110mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液：在160mL水中加入80.0g氫氧化鈉，溶解后，冷卻至室溫，再加水定容至200mL。0.5mol/LEDTA-Na2)溶液(pH8.0)186gmL4.3EDTA-Na24.3pH8.0100mL12120min。1mol/ITris-HCI(pH8.0)121.1g800mLpH8.01000mL12120min。TEpH8.0)10mL4.52mL4.41000mL12120min。50×TAE緩沖液：稱取242.2g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，先用500mL水加熱攪拌溶解后，加入100mLpH1000mL1×TAE。加樣緩沖液：稱取250.0mg溴酚藍，加入10mL水，在室溫下溶解12h；稱取250.0mg二甲基10mL50.0g30mL3100mL4PremixTaqPremixTaqCMV病毒檢測上游引物CMV-F:5′-TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3′CMV-R:5′-AGACGTGGGAATGCGTTGGTGCT-3′。預期擴增目的片段大小為345bp(參見附錄A中的A.1)。WMVWMV-F:5′CCAGTGGCAAAGGTGATA-3′WMV-R:5′TGCTGCGTCTGAGAAATG-3′。預期擴增目的片段大小為485bp(參見附錄A中的A.2)。ZYMV病毒檢測上游引物ZYMV-F:5′-ATGCAGAGGCACCATACAT-3′，下游引物ZYMV-R:5′-TACTGCATTGTGTTCACACC-3′283bpAA.3)。TE4.6）10μmol/L。TRIzolTransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMixPCR產(chǎn)物回收試劑盒。pMD18-T載體。大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a。5儀器和設(shè)備分析天平。組織研磨儀。PCR擴增儀。電泳槽、電泳儀等電泳裝置。Nanodrop微量分光光度計。凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)。以經(jīng)過RT-PCR擴增和測序分析精確含有CMV、WMV、ZYMV的樣品為陽性對照。經(jīng)過RT-PCR擴增和測序分析精確不含有CMV、WMV、ZYMV的樣品為陰性對照。以滅菌ddH2O為空白對照。采集適量的籽用西葫蘆種子，放入自封袋中封口后及時進行分析。如需保存可置于-80℃冰箱中。樣品應避免交叉污染。RNA提取和純度檢測2RNA500.1g2mL1mLTRIzolRNA。RNARNANanodropRNAOD260/OD2801.8～2.0RT-PCRRNA1g100mL1×TAE2μL1×TAE2μLRNA4μLDNARNA反轉(zhuǎn)錄2以總NADN1μgRNA1μLnchredOligo（dT）18RNase-FreeddH2O655min2min10μL2×TS1μL1μLgDNARemover4230min855sec-20PCR擴增PCR21PCR表1PCR試劑體積PremixTaq25μLcDNA2μL10μmol/L上游引物1μL10μmol/L下游引物1μLddH2O補足50μLPCR2secPCRPCRPCR3min30sec305850ZYMV50℃），72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。PCRPCR瓊脂糖凝膠電泳檢測1g100mL1×TAE2μL1×TAE2μLRNA4μLDNAPCRDNA8.4.3PCR4pMD18-TCMV、WMVZYMVAPCRDNADNA片段。CMV基因檢測結(jié)果分析RT-PCR345bpBB.2）CMVCMVCMVCMVCMVCMVCMVRNA，RT-PCRWMV基因檢測結(jié)果分析RT-PCR485bp（BB.2）WMVWMVWMVWMVWMVWMVWMVRNA，RT-PCRZYMV基因檢測結(jié)果分析RT-PCR283bp（BB.2）ZYMVZYMVZYMVZYMVZYMVZYMVZYMVRNART-PCR附錄A（資料性）籽用西葫蘆種子CMV/WMV/ZYMV特異性片段序列CMVWMVZYMV注1：序列方向為5′-3′。注2：5′下劃線為PCR方法上游引物序列，3′下劃線為PCR方法下游引物的反向互補序列。附錄B（資料性）籽用西葫蘆種子CMV/WMV/ZYMVRT-PCR檢測電泳圖RNAB.1。28s18s5s圖B.1籽用西葫蘆種子總RNA電泳圖CMV/WM