微生物遺傳學(xué)第四章細(xì)菌轉(zhuǎn)移課件

第四章 細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移和基因重組2023/9/21第二節(jié)接合(conjugation)2023/9/21供體菌（F+）通過(guò)性菌毛與受體菌（F-）直接接觸，把

F質(zhì)?；蚱鋽y帶的不同長(zhǎng)度的核基因組片段傳遞給后者，并使其獲得若干新遺傳性狀

的現(xiàn)象。大腸桿菌的接合能進(jìn)行接合的微生物種類主要在細(xì)菌和放線菌中進(jìn)行。細(xì)菌中，尤其G-菌較為普遍。接合還可發(fā)生在不同屬的一些菌種間。接合的意義

抗生素抗性外毒素抗性新的代謝能力2023/9/21通過(guò)接合而獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞叫接合子。介導(dǎo)接合作用的質(zhì)粒叫接合質(zhì)粒(自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、性質(zhì)粒)。2023/9/21

接合的特征

2023/9/21特征1：需要供體細(xì)胞和受體細(xì)胞的直接接觸，在G-是通過(guò)質(zhì)粒編碼的性菌毛介導(dǎo)的，在G＋細(xì)菌中沒(méi)有性菌毛，由受體細(xì)胞分泌類似于性激素的短肽刺激細(xì)胞接合。特征2：需要質(zhì)粒參與。G-細(xì)菌中質(zhì)粒分子量較大，有幾十個(gè)tra基因參與DNA轉(zhuǎn)移，而G＋細(xì)菌中質(zhì)粒小，只有幾個(gè)tra基因參與DNA轉(zhuǎn)移。2023/9/21特征3：無(wú)論G-或G＋，質(zhì)粒能只從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移.是自然界微生物遺傳物質(zhì)交換的重要途徑。大腸桿菌，自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒是F因子。2023/9/211.

接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與證實(shí)2023/9/211946年，J.Lederberg

&

Tatum的大腸桿菌雜交試驗(yàn)：材料：大腸桿菌(E.

coli)

K12菌株的兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型品系：菌株A—甲硫氨酸缺陷型met-和生物素缺陷型bio-；菌株B—蘇氨酸缺陷型thr-和亮氨酸缺陷型leu-。方法：將A、B兩菌株混和，在基本培養(yǎng)基(固體)上涂布培養(yǎng)。結(jié)果：平板上長(zhǎng)出原養(yǎng)型菌落(++++)。+結(jié)果原養(yǎng)型菌株以10-5－10-6的頻率出現(xiàn)2023/9/21-？質(zhì)疑：⑴

細(xì)菌的雜交實(shí)驗(yàn)獲得的重組子可能是轉(zhuǎn)化的結(jié)果。⑵

培養(yǎng)基中含有某些代謝產(chǎn)物，混合后這些產(chǎn)物互相補(bǔ)充了對(duì)方的不足而得以在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。2

023/9(/213)

回復(fù)突變2023/9/21轉(zhuǎn)化的排除（1）當(dāng)時(shí)Lederberg

和Tatum已證明，把菌株A的培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)滅菌，再加入到B菌株的培養(yǎng)液中，沒(méi)有原養(yǎng)型菌落，說(shuō)明并非轉(zhuǎn)化的結(jié)果。2023/9/21證實(shí)接合過(guò)程需要細(xì)胞間的直接接觸的“U”型管實(shí)驗(yàn)（

Bernard

Davis，1950

）轉(zhuǎn)化的排除(2)互養(yǎng)的排除營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株通過(guò)培養(yǎng)基交換養(yǎng)料而生長(zhǎng)的現(xiàn)象稱為互養(yǎng)。如將基因型A-B+T1s和A+B-T1r兩菌株在基本培養(yǎng)基上混合培養(yǎng)，接觸較短的一段時(shí)間以后，噴上噬菌體T1,把A-B+T1s殺死，經(jīng)培養(yǎng)后仍有原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)。A-B+T1sA+B-T1rT12023/9/21回復(fù)突變的排除2023/9/21大腸桿菌的突變率一般都是<10-8，若兩個(gè)基因同時(shí)回復(fù)突變，則可能性只有<10-16，這種幾率在平板上是很難檢測(cè)到的，所以混合培養(yǎng)能出現(xiàn)10-5-10-6頻率的菌落一定是重組的結(jié)果。J.

Lederberg,

E.

Tatum

(1946)14.11MCB

140

2/16/0515Novel

genotypes

in

mixed

cultures

of

biochemical

mutants

ofbacteria.

Cold

Spring

Harbor

Symp.

Quant.

Biol.

11:113-114.草履蟲(chóng)MCB

1402/16/05162023/9/21W.Hayes的實(shí)驗(yàn)（1952）該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明細(xì)菌接合過(guò)程中遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是單向的，即遺傳物質(zhì)從A株轉(zhuǎn)移到了B株。A:

met-

bio-

thr+

thi+B:

met+bio+

thr-

thi-大腸桿菌的兩種類型

2023/9/21Hayes(1952)研究表明：大腸桿菌兩種不同菌株(品系)接合過(guò)程中遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是單向的；從而認(rèn)為大腸桿菌存在兩種類型：雌性與雄性，分別作為接合過(guò)程中遺傳物質(zhì)的受體與供體。供體菌稱為雄性菌，受體菌稱為雌性菌。有學(xué)者認(rèn)為，具有性菌毛的細(xì)胞可以叫做

雄性，這種細(xì)絲狀的菌毛像一種分子陰莖，與缺乏性菌毛的雌性細(xì)胞交合（德迪夫

1999）。威廉斯（

2001）的觀點(diǎn)：“在細(xì)菌和病毒以及在所有高等生命體的主要類型中，遺傳重組現(xiàn)象的存在表明，性別的分子基礎(chǔ)是來(lái)自遠(yuǎn)古的進(jìn)化演變的產(chǎn)物”。2023/9/212.F質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)2023/9/21證明了細(xì)菌的接合是遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移后，

Hayes偶然發(fā)現(xiàn)了作為原始供體的A菌在冰箱里存放了一年后出現(xiàn)一種變種，變種和正常的B菌雜交時(shí)缺乏將遺傳物質(zhì)傳給B菌株的能力。他把這個(gè)不育變種的一個(gè)Strr

突變型分離出來(lái)，并把它和可育的Strs

A菌株一起繁殖，將其涂布在含有鏈霉素的平板上，分離后再和B菌株雜交，結(jié)果使不育的菌株回復(fù)了可育性（大約1/3恢復(fù)）。大腸桿菌的可育性解釋2023/9/21

A菌株之所以能成為供體，是因?yàn)樗幸粋€(gè)性因子（sexfactor），又稱致育因子（fertility

factor），簡(jiǎn)稱F因子。F因子的特點(diǎn)2023/9/21①

大腸桿菌的供體或雄性細(xì)胞記為F＋，帶有一個(gè)性因子或致育因子F，而另一個(gè)不帶性因子F的受體細(xì)胞或雌性細(xì)胞記為F-②

雜交F+ХF－是可育的，雜交F-

Х

F-是不育的③

F因子可以轉(zhuǎn)移，從F+到F-，但必須通過(guò)細(xì)胞接觸④

F因子能自發(fā)喪失，一旦喪失就不能再恢復(fù)，除非從一個(gè)F+再把它傳遞過(guò)來(lái)。⑤

F+是一種遺傳性狀，F(xiàn)因子的存在使細(xì)菌稱為F+，F(xiàn)因子的喪失使細(xì)菌成為F-，F(xiàn)+分裂仍得到F+細(xì)胞。2023/9/21⑥

其特性類似于染色體，但染色體基因轉(zhuǎn)移的頻率不超過(guò)

10-6，F(xiàn)因子轉(zhuǎn)移的頻率高達(dá)70％以上。因此，F(xiàn)因子就是質(zhì)粒Lederberg,

J.,

Cavalli,

L.

L.,andLederberg,

E.

M.,

Nov.

1952,"Sexcompatibility

in

Escherichia

coli",

Genetics37(6):720-7303.F質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)2023/9/21已經(jīng)對(duì)F質(zhì)粒的基因組進(jìn)行了全序列測(cè)定。F質(zhì)粒為雙鏈環(huán)狀DNA分子，DNA長(zhǎng)度為99159bp（約100kb），約是大腸桿菌基因組的2％，其中

1/3的基因與接合作用有關(guān)。整個(gè)基因組由3個(gè)主要區(qū)段組成：轉(zhuǎn)移區(qū)、復(fù)制區(qū)、插入?yún)^(qū)。2023/9/21轉(zhuǎn)移區(qū)2023/9/21轉(zhuǎn)移區(qū)的長(zhǎng)度為33kb，由23個(gè)基因組成，構(gòu)成一個(gè)tra操縱子。與性菌毛的形成有關(guān)?？刂苹蜣D(zhuǎn)移該區(qū)最后進(jìn)入受體細(xì)胞復(fù)制區(qū)2023/9/21復(fù)制區(qū)負(fù)責(zé)F質(zhì)粒的自我復(fù)制，F(xiàn)質(zhì)粒的自主復(fù)制區(qū)為oriV，在oriV中包含復(fù)制起點(diǎn)。F質(zhì)粒的復(fù)制是按θ型方式進(jìn)行雙向復(fù)制，是一種嚴(yán)緊型質(zhì)粒，1-2拷貝/細(xì)胞。Inc基因產(chǎn)物使細(xì)胞具有不相容性。插入?yún)^(qū)2023/9/21包含4個(gè)插入順序：2個(gè)IS3，一個(gè)IS2，1個(gè)Tn1000，它們與F質(zhì)粒的整合、切除和易位有關(guān)。F因子為附加體質(zhì)粒，既可以脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可插入（整合）到染色體上2023/9/21高頻重組(High

frequencerecombination,Hfr)2023/9/211951年 Cavalli發(fā)現(xiàn)用氮芥處理F＋ 然后將處理后的F＋×F－—1—0－41954年

Hayes 也分離了Hfr品系，發(fā)現(xiàn)：(1)Hfr使重組能力增加，但無(wú)傳遞F因子的能力，Hfr×F

F－

－(2)Hfr只能將供體基因組的一部分傳給受體，Hayes的解釋是Hfr的F因子發(fā)生了永久性改變。＋

－

F

×F

Hfr2023/9/214. F質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)根據(jù)細(xì)胞中是否存在Ｆ因子以及其存在方式的不同，可把E.coli分以下四種相互有聯(lián)系的接合型的菌株。a）F-菌株， 不含F(xiàn)因子，沒(méi)有性菌毛，但可以通過(guò) 接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）；F+菌株，

F因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛。

d）F′菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。 細(xì)胞表面同樣有性菌毛。2023/9/21細(xì)菌接合的電鏡照片2023/9/215.F質(zhì)粒與接合作用2023/9/21(1)

F+×F-雜交帶有F質(zhì)粒的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上與F－明顯區(qū)別。除共有大量的表面菌毛外，F(xiàn)＋還有少量性菌毛。接合作用分兩步:接合配對(duì)和DNA轉(zhuǎn)移F+菌株的F因子向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但含F(xiàn)因子的宿主細(xì)胞的染色體DNA一般不被轉(zhuǎn)移。2023/9/21①

F+細(xì)菌通過(guò)性毛與F-細(xì)菌接觸并發(fā)生相互作用，產(chǎn)生胞質(zhì)橋；2023/9/21②

F+細(xì)菌的F因子出現(xiàn)缺口，雙鏈之一被切斷，從斷端轉(zhuǎn)移F因子的一條鏈到F-細(xì)菌中。③

F因子的一條鏈一進(jìn)入F-細(xì)菌中，就在F-細(xì)菌中復(fù)制新的F因子。④

復(fù)制完成后，F(xiàn)-細(xì)菌變成F+，同時(shí)原有F+細(xì)胞也完成F因子另一條鏈的復(fù)制，所以轉(zhuǎn)移是F+的拷貝。最終雜交的結(jié)果是F-細(xì)菌變成F+細(xì)菌，而原有的F+細(xì)菌則不變。(2)Hfr

×F-雜交2023/9/21Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移過(guò)程，就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給F-細(xì)胞并發(fā)生重組，由此為高頻重組菌株。質(zhì)粒通過(guò)不同的機(jī)理整合到染色體上，包括質(zhì)粒和染色體序列的同源重組。正常的重組需要兩個(gè)DNA之間有同源性，但大多數(shù)質(zhì)粒的序列具有不同于染色體的獨(dú)特性。但質(zhì)粒和染色體有共同插入序列和轉(zhuǎn)座因子。這些轉(zhuǎn)座因子間的同源重組可導(dǎo)致質(zhì)粒的整合。

插入如何產(chǎn)生Hfr?

大腸桿菌染色體有7個(gè)IS1、13個(gè)IS2和6個(gè)IS3，F(xiàn)質(zhì)粒有1個(gè)IS2和2個(gè)IS3，因此大腸桿菌染色體上有19個(gè)IS介導(dǎo)的Hfr形成位點(diǎn)。F質(zhì)粒插入染色體上位置隨機(jī)，方向隨機(jī)，結(jié)果產(chǎn)生不同的Hfr菌株。2023/9/212023/9/21Hfr菌株的形成及其基因重組Hfr與F-菌株接合過(guò)程2023/9/21Hfr菌株仍然保持著F+細(xì)胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一樣與F-細(xì)胞進(jìn)行接合。所不同的是，當(dāng)OriT序列被酶識(shí)別而產(chǎn)生缺口后，F(xiàn)因子的先導(dǎo)區(qū)(leadingregion)結(jié)合著染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。F因子除先導(dǎo)區(qū)以外，其余部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端，由于轉(zhuǎn)移過(guò)程常被中斷，因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中。Hfr與F-菌株接合結(jié)果2023/9/21Hfr×F-雜交后的受體細(xì)胞(或接合子)大多數(shù)仍然是F-。染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的時(shí)間就越早，頻率也高。2023/9/21（3）F′×F-雜交2023/9/21Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。F′×F-與F+×F-的不同：供體的部分染色體基因隨F′一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞a）與染色體發(fā)生重組；b）繼續(xù)存在于F′因子上，形成一種部分二倍體；n

細(xì)胞基因的這種轉(zhuǎn)移過(guò)程又常稱為性導(dǎo)（sexduction）、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-duction），或F因子媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-mediated

transduction）。2023/9/212023/9/21部分二倍體：2023/9/21

當(dāng)Hfr菌的部分染色體進(jìn)入F－細(xì)胞后，F(xiàn)－細(xì)胞中就成為部分二倍體（partialdiploid）或部分合子（merozygote）。6.中斷雜交（interrupted

mating）技術(shù)2023/9/21Hfr細(xì)菌和F-接合后，染色體按一定速度和方向進(jìn)入F-，由于DNA轉(zhuǎn)移從oriT起始，F(xiàn)質(zhì)粒的主要部分應(yīng)該在最后進(jìn)入受體，但雜交后，

F-并不轉(zhuǎn)變?yōu)镕＋說(shuō)明大部分F因子并沒(méi)有進(jìn)入受體。利用Hfr×F-的接合過(guò)程，在不同時(shí)間取樣，并把樣品猛烈攪拌以分散接合中的細(xì)菌，然后分析受

體細(xì)菌基因型，以時(shí)間(分鐘)為單位繪制遺傳圖

譜，該圖譜是細(xì)菌染色體上基因順序的直接反映。中斷雜交實(shí)驗(yàn)作圖(interrupted

matingexperiment)中斷雜交實(shí)驗(yàn)

1957年E.Wollman和E.Jacob設(shè)計(jì)完成供體：Hfr受體：F－strs

thr＋

leu＋

azirstrr

thr－

leu－

azistonr

lac＋

gal＋tons

lac－gal－中斷雜交F－Hfr雜交一定時(shí)間間隔基本培養(yǎng)基含鏈霉素thr+leu+strr重組子2023/9/21將大約10倍的F-菌和Hfr對(duì)數(shù)期的菌混合，輕輕振蕩培養(yǎng)，在不同時(shí)間間隔取樣，然后在組織攪拌器中劇烈振蕩。振蕩后的培養(yǎng)物涂布于加了鏈霉素的基本培養(yǎng)基上，篩選thr+

leu+

strr重組子。再對(duì)每一個(gè)重組子的非選擇性標(biāo)記azi

ton

lac

gal進(jìn)行測(cè)定。2023/9/212023/9/21從圖可知，混合5分鐘后取樣時(shí)，所得菌落的非選擇標(biāo)記全部和F-菌株相同，表明還沒(méi)有任何Hfr菌的基因進(jìn)入受2023/9/21體菌。混合10分鐘取樣，重組體中有10％含Hfr的azi基因，但幾乎沒(méi)有ton和gal基因，25分鐘時(shí)，gal基因才出現(xiàn)。在60分鐘后，thr+leu+strr重組體的數(shù)目達(dá)到最高點(diǎn)，非選擇性供體標(biāo)記趨于平衡。在這些重組體之間，非選擇性供體標(biāo)記從azi基因的90％到gal基因的25％。因此Hfr和F雜交建立起穩(wěn)定的接合對(duì)時(shí)，供體的染色體的轉(zhuǎn)移是從一個(gè)固定點(diǎn)開(kāi)始的，以0－thr-leu-azi-ton-