黑水城種燕的顯微鑒別與藥理活性研究

黑水城種燕的顯微鑒別與藥理活性研究

燕子是科沃代亞科金蠶絲燕的幾種雜草分泌的唾液，與苔蘚混合，在懸崖上收集。主要產(chǎn)于東南亞。商品名稱包括燕菜、燕菜、燕菜、燕根等。性平，味甘，具有益肺養(yǎng)陰的功效，主要用于脾虛、咳嗽、咳嗽等疾病[1.3]。燕窩作為一種名貴中藥,利潤(rùn)豐厚,市場(chǎng)上摻假、售假行為嚴(yán)重,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)燕窩的真?zhèn)舞b別和藥理作用進(jìn)行了大量的研究,為鑒別燕窩真?zhèn)翁峁└鞣N方法,同時(shí)進(jìn)一步確認(rèn)了其藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文針對(duì)燕窩的鑒別方法和藥理作用研究現(xiàn)狀進(jìn)行分析,為燕窩真?zhèn)舞b別和品質(zhì)功效研究提供重要的參考依據(jù)。修回日期:2012-08-23一、生藥的鑒定1.小球物、硬脆材料、黑ph肉肉的等圖2正品燕窩為完整半月球形或類船形,邊緣較整齊,為類白色或者黃白色(白燕),淡紅色、紅色、紅棕色或深紅色(血燕),長(zhǎng)5.5~10.5cm,寬3~5cm,厚約1cm;內(nèi)側(cè)粗糙,凹陷成窩,底部及兩側(cè)絲瓜絡(luò)樣,較均勻,外側(cè)面隆起,略顯橫向條紋,中部常有裂隙,常雜有灰黑色的細(xì)羽絨及有色物;質(zhì)硬而脆,半透明;斷面有角質(zhì)樣光澤;氣微腥,味微咸,嚼之先爽口后有粘滑感。性狀鑒別法可以用于一般加工品的鑒別,但不適合用于各種燕窩加工品的鑒別。**通訊作者:賴小平,本刊編委,教授,博士,廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院(新藥開(kāi)發(fā)研究中心)院長(zhǎng)(主任),東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研2.燕普組合的顯微特征陸漢豪觀察燕窩水裝片的半透明碎塊和用水合氯醛裝片觀察雜質(zhì),發(fā)現(xiàn)正品燕窩呈不規(guī)則形,表面具平行紋理,偶見(jiàn)燕毛。王鋼力等觀察了燕窩及其制品中的絨羽碎片,發(fā)現(xiàn)絨羽為棕色至棕褐色,羽軸呈透明圓柱形,髓部網(wǎng)格狀,內(nèi)充滿棕褐色色素,羽軸兩側(cè)生出羽枝,羽枝兩側(cè)生出羽小枝,羽小枝末端多數(shù)有兩尖刺等特征。劉寶玲等發(fā)現(xiàn)燕窩粉末碎片表面及斷面具有細(xì)密紋理(多平直或略彎曲,某些呈弧狀、放射狀、團(tuán)塊隱約可見(jiàn)交叉的橫向條紋,梭形紋理極少),偶見(jiàn)不具紋理的小塊片;豬皮屑、銀耳、瓊脂的粉末顯微特征與上述特征差異較明顯,據(jù)此即可區(qū)別正品燕窩及其摻偽品,且結(jié)論較為確切。劉惠娟等對(duì)燕窩與其加工品、常見(jiàn)摻偽品的顯微特征進(jìn)行比較研究,進(jìn)一步證明顯微觀察法可應(yīng)用于燕窩的真?zhèn)舞b別。劉惠敏等采用SEM電鏡對(duì)正品燕窩和偽品燕窩進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察時(shí)發(fā)現(xiàn),在SEM電鏡下,正品燕窩分層排列,呈現(xiàn)規(guī)則的窩狀,而偽品燕窩呈不規(guī)則顆粒狀。林潔茹等首次使用體視鏡對(duì)燕窩進(jìn)行鑒別,通過(guò)在體視鏡下觀察燕窩正品與偽品的性狀,快速有效地區(qū)分燕窩碎與偽品銀耳以及識(shí)別涂膠燕窩。3.配方的表面流程正品燕窩在365nm燈下顯微藍(lán)白色,燕窩加工品呈綠白色、藍(lán)紫色或者灰綠色。燕窩膨脹率達(dá)60%,且泡沫豐富;正品燕窩水溶液與印三酮反應(yīng)顯藍(lán)紫色、與稀鹽酸反應(yīng)顯棕褐色或棕黑色、與堿性酒石酸銅反應(yīng)產(chǎn)生紅色沉淀;燕窩水煮溶液應(yīng)為銀白色絲狀透明,上層液清亮;正品燕窩加入碘試液只顯碘本身顏色,水洗即褪。上述均與正品燕窩與之反應(yīng)所得結(jié)果存在不同程度的差異。4.燕麥的紫外光譜測(cè)定(1)紫外可見(jiàn)分光光度法。馮夏紅等測(cè)定白燕正品與另外兩種燕窩產(chǎn)品的紫外吸收光譜圖,結(jié)果顯示白燕正品水提液在277.8nm波長(zhǎng)處有明顯吸收,另外兩種產(chǎn)品無(wú)明顯紫外吸收峰,說(shuō)明這兩種產(chǎn)品不含蛋白質(zhì),為非正品燕窩。朱春紅等檢測(cè)到血燕、黃燕、彩燕、白燕、燕片等5種燕窩在280nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收峰,且各樣品峰形相近,而偽品豬皮、銀耳均在280nm波長(zhǎng)附近沒(méi)有明顯吸收峰,可與正品區(qū)別。周輝等用紫外光譜掃描多種燕窩及其偽品,結(jié)果顯示白燕、血燕和草燕的最大吸收波長(zhǎng)接近,分布在275.6~277nm之間,而偽品的最大吸收波長(zhǎng)分別為瓊脂282nm、銀耳267nm、魚(yú)翅276nm、豬皮263nm,證明燕窩的紫外最大吸收波長(zhǎng)與除魚(yú)翅外的偽品均有明顯區(qū)別。陸源等測(cè)定正品燕窩和國(guó)內(nèi)地方習(xí)用品的最大吸收波長(zhǎng),結(jié)果顯示正品燕窩與土燕窩均為280nm,龍牙燕窩為285~290nm。(2)紅外光譜法。孫素琴等利用紅外光譜法對(duì)6種燕窩進(jìn)行了原性狀快速鑒別,得出了5種天然燕窩和一種市售燕窩的紅外光譜圖,根據(jù)譜圖的差異可用于燕窩真?zhèn)纹返蔫b別。鄧月娥等用FTIR光譜法對(duì)30種干燕窩產(chǎn)品進(jìn)行了質(zhì)量檢測(cè),結(jié)果表明這些譜圖與天然燕窩的紅外光譜圖均有不同程度的差異,主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)、氨基酸和多糖等主要營(yíng)養(yǎng)成分的吸收峰,該方法可簡(jiǎn)便、快速、直觀地評(píng)價(jià)燕窩產(chǎn)品的質(zhì)量。5.發(fā)酵藥物的測(cè)定(1)高效液相色譜法。姜水紅等以磷酸水解燕窩蛋白,經(jīng)反相色譜柱分離在192nm下測(cè)定唾液酸含量,結(jié)果顯示各種燕窩樣品的唾液酸含量為6.54%~10.79%,此法能準(zhǔn)確地檢測(cè)出燕窩中的唾液酸含量。王慧等用硫酸氫鈉水解燕窩,加入鄰苯二胺鹽酸鹽使唾液酸衍生化,用HPLC-UV法在230nm下測(cè)定燕窩中唾液酸的含量,結(jié)果表明9種燕窩的唾液酸含量在7.2%~10.4%之間,白燕、血燕和毛燕中唾液酸的含量沒(méi)有顯著性差異,而偽品豬皮和明膠沒(méi)有唾液酸色譜峰,可據(jù)此進(jìn)行真?zhèn)舞b別。華永有等用唾液酸衍生化法在201nm下測(cè)定以燕窩類保健品中唾液酸的含量,該方法可準(zhǔn)確測(cè)定燕窩類保健品中唾液酸的含量,是鑒別真假燕窩制品行之有效的方法。馮婷玉等采用DAD/FLD串聯(lián)HPLC法,以鄰苯二胺鹽酸鹽為衍生化試劑對(duì)唾液酸進(jìn)行定量測(cè)定,兩個(gè)檢測(cè)器串聯(lián)使用,可以彌補(bǔ)各自的不足,保證待測(cè)唾液酸在各濃度下能被準(zhǔn)確檢出。詹華強(qiáng)等采用高效液相色譜三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(HPLC-QQQ)測(cè)定燕窩的游離唾液酸含量來(lái)鑒定燕窩真?zhèn)?是鑒別燕窩真?zhèn)魏推焚|(zhì)優(yōu)劣客觀科學(xué)的好方法。(2)氣相色譜法。喻雨琴、王慧等用氣相色譜法測(cè)定燕窩及燕窩飲品水解后4~5個(gè)醛糖組分的含量,這些醛糖組分有特定的比例,構(gòu)成易于識(shí)別的燕窩“指紋”圖,可一次完成燕窩及其制品的定性鑒定及分析。陳文銳運(yùn)用毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定燕窩中氨基酸的總含量、組成以及某些氨基酸在摻假物中比例的變化,提出一套通過(guò)氣相方法構(gòu)建燕窩氨基酸圖譜,判斷燕窩摻假成分以及測(cè)定含量的方法,此法避免檢測(cè)過(guò)程中糖類物質(zhì)的干擾,簡(jiǎn)化了測(cè)定前處理,具有較高的可行性。(3)氨基酸分析法。朱春紅等利用氨基酸分析法鑒定燕窩真假,再用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行確證,結(jié)果表明氨基酸分析法可以準(zhǔn)確檢測(cè)燕窩及燕窩制品中各種氨基酸的構(gòu)成比,該法簡(jiǎn)便可行,結(jié)果可靠。陳丹等用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)得燕窩18種氨基酸總含量為45.87%。候惠蟬用HPLC法測(cè)得印度尼西亞產(chǎn)的燕窩16種氨基酸總含量為46%~49%,廣東懷集習(xí)用的燕窩則為43%~49%,而且兩者氨基酸比例相似。陸源用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)得土燕窩和龍牙燕窩總氨基酸含量為33%~40%。上述研究對(duì)燕窩氮含量的測(cè)定均采用了凱氏定氮法,結(jié)果顯示燕窩的氮含量有一穩(wěn)定的范圍,且與各種偽品有較大區(qū)別。6.燕麥蛋白的譜帶分析干國(guó)平采用尿素解離燕窩蛋白進(jìn)行常規(guī)聚丙烯酰胺膠電泳(Polyacryamidegelelectrophoresis,PAGE),發(fā)現(xiàn)白燕和毛燕有相同的PAGE圖譜,兩者均有7條譜帶,血燕則有8條譜帶,大部分譜帶位置與白燕和毛燕有區(qū)別,而銀耳、豬皮、瓊脂等偽品無(wú)相關(guān)譜帶。馮夏紅以解離的燕窩蛋白進(jìn)行常規(guī)PAGE,得正品燕窩有8條譜帶,偽品燕窩沒(méi)有譜帶。胡珊梅以燕窩蛋白進(jìn)行PAGE,樣品先經(jīng)過(guò)濃縮膠濃縮,然后進(jìn)入分離膠分離,電泳結(jié)果顯示正品燕窩有10~11條譜帶;燕碎的譜帶數(shù)與正品燕窩相同,但譜帶位置略有不同,在Rf<0.36的區(qū)段缺少1條譜帶,而在Rf<0.69的區(qū)段多了一條譜帶;其余草燕、燕球、燕條等的譜帶與正品燕窩均有較大區(qū)別。林潔茹等以SDS進(jìn)行燕窩蛋白分離,發(fā)現(xiàn)正品燕窩的圖譜與偽品銀耳、明膠、豬皮以及地方習(xí)用品懷集燕窩有明顯區(qū)別,但燕窩的SDS的譜帶欠清晰;若以等電焦聚電泳進(jìn)行蛋白分離,可發(fā)現(xiàn)燕窩蛋白根據(jù)等電點(diǎn)不同,在膠條的酸性端形成若干清晰的條帶。Massimo取血燕窩和白燕窩的總蛋白進(jìn)行SDS實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示前者有4條蛋白質(zhì)條帶,分子量均大于33kDa,后者僅出現(xiàn)第2和第3條帶,故可作鑒別依據(jù)。7.糖蛋白的檢測(cè)崔慧娥等采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫方法(Enzyme-LinkedImmunoassay,ELISA)檢測(cè)燕窩的特異糖蛋白,所建方法特異性強(qiáng)、可有效用于燕窩摻假的鑒別。林潔茹首先采用DNA序列分析技術(shù)對(duì)燕窩中殘留的金絲燕絨毛及口腔上皮細(xì)胞的線粒體DNA進(jìn)行測(cè)序,從而對(duì)其基源進(jìn)行鑒定。DNA序列分析技術(shù)法是目前對(duì)鑒別真假燕窩的一個(gè)科學(xué)有效的方法,但其實(shí)驗(yàn)條件要求較高且費(fèi)用昂貴。二、藥理作用1.功能性燕麥提取物Howe等從燕窩水提液中得到的一種粘病毒血凝反應(yīng)抵制劑,對(duì)各種流行性感冒病毒的神經(jīng)氨酸酶敏感,其抵制的毒譜很寬,包括流感病毒的A2(Asian)毒株等。Biddle指出金絲燕類粘蛋白不僅是流感病毒血凝反應(yīng)的有效抑制劑,而且也是一種中和傳染性的有效物質(zhì)。Yagi等發(fā)現(xiàn)食用燕窩提取物能以獨(dú)立的方式抑制流感病毒感染。這種抗病毒活性可能與O型或者N型糖復(fù)合物有關(guān),但是目前沒(méi)有用氮聚糖結(jié)構(gòu)描述食用燕窩。Guo等也發(fā)現(xiàn)燕窩提取物與胰酶F水解時(shí)能以獨(dú)立的方式強(qiáng)烈抑制流感病毒感染,同時(shí)Westernblotting電泳檢測(cè)結(jié)果表明,提取液能與甲型流感病毒(H3N2)結(jié)合;燕窩提取物能化解帶有流感病毒的MDCK細(xì)胞的感染和抑制紅細(xì)胞流感病毒的血凝,但不能抑制流感病毒唾液酸酶的活性。林潔茹采用體外試驗(yàn)檢測(cè)3種燕窩提取物對(duì)H5N1禽流感假病毒活性的影響,對(duì)H5、H7、H9型陽(yáng)性抗原凝血作用的影響,以及對(duì)N1型神經(jīng)氨酸酶活性的影響,結(jié)果顯示燕窩提取物抗病毒的作用可能通過(guò)抑制包膜蛋白上血凝素的活性而實(shí)現(xiàn),即血凝素可能是燕窩提取物抗病毒的作用靶點(diǎn)。2.凝集素及其應(yīng)用Ng觀察發(fā)現(xiàn)燕窩水提物對(duì)人外周單核細(xì)胞在凝集素刺激下的有絲分裂有促進(jìn)作用,尤其在凝集素未達(dá)最適宜濃度時(shí)最為顯著,其活性物質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶解后作用不變。江潤(rùn)祥等從小白腰雨燕燕窩水提物分離得一活性成分EGF-2,其對(duì)小鼠3T3成纖維細(xì)胞顯強(qiáng)力促細(xì)胞分裂作用;Kyung等發(fā)現(xiàn)燕窩提取物對(duì)人類脂肪干細(xì)胞(hADSCs)有增殖作用。3.小鼠細(xì)胞免疫功能檢測(cè)張玫等發(fā)現(xiàn)珍珠燕窩提取液能提高T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及提高小鼠血清IgM含量,同時(shí)可顯著降低小鼠腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化作用和提高RBC內(nèi)SOD水平,說(shuō)明該提取液既能提高小鼠的細(xì)胞免疫功能,又能提高體液免疫功能,還有延緩衰老、消除氧自由基、抗輻射、防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用。Noriko等發(fā)現(xiàn)口服燕窩提取物可提高去卵巢大鼠的骨強(qiáng)度和股骨的鈣離子濃度,且真皮厚度也因燕窩提取物的補(bǔ)充而增長(zhǎng),但不會(huì)影響血清雌二醇的濃度,此結(jié)果說(shuō)明燕窩提取物對(duì)絕經(jīng)女性的骨質(zhì)流失和皮膚老化具有改善作用。4.糖蛋白的用量藤岡睦研究表明,燕窩提取物對(duì)心率沒(méi)有影響,但可顯著增強(qiáng)心收縮力,有強(qiáng)心作用。Flasher等發(fā)現(xiàn)燕窩中唾液酸糖蛋白可與花生凝集素結(jié)合,從而抑制花生凝集素的凝集,去除