高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法鑒別金銀花與山銀花及其制劑

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法鑒別金銀花與山銀花及其制劑

1973年版《中國藥典》首次收錄了蜂蜜。只有一種植物來自耐心科植物?！吨袊幍洹?977年版增加了3種:紅腺忍冬、山銀花和毛花柱忍冬,這種多來源的金銀花在全國使用了28年。根據(jù)“中藥材內(nèi)含成分差別較大的多來源品種,按一物一名的原則逐步分列”,《中國藥典》2005年版分列為金銀花和山銀花,金銀花只保留了忍冬科植物忍冬一種來源;另收載山銀花,來源為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬和華南忍冬?！吨袊幍洹?010年版山銀花藥材項下增收了黃褐毛忍冬。金銀花和山銀花為近緣植物,藥材的形狀特征比較相似,藥典所記載的二者的性狀,用于鑒別有一定困難。而且制成提取物或制劑后,由于沒有很好的鑒別檢測手段,無法區(qū)分投料的藥材來源,部分廠家考慮到目前市場上金銀花與山銀花的價格差異,為節(jié)約成本改用山銀花或摻加山銀花投料,這勢必對一些正規(guī)按金銀花投料的同品種廠家造成不正當競爭。因此規(guī)范金銀花與山銀花的使用,增加鑒別檢測方法尤為必要。本試驗以灰氈毛忍冬皂苷乙為指標,建立山銀花的HPLC檢查方法?？疾炝?7批金銀花和山銀花藥材以及分別用金銀花和山銀花制備提取物后灰氈毛忍冬皂苷乙的檢出情況,驗證了方法的可行性。并對收集的21批金銀花提取物和13批銀黃片進行檢測,為規(guī)范金銀花藥材市場提供技術(shù)支持。1儀器和試劑盒1.1儀器十二十制高效液相層析成像；sartoriusbp2115d電子秤1.2ps20020601灰氈毛忍冬皂苷乙對照品:成都普思生物科技有限公司,批號:PS10020701;樣品:17批藥材見圖2標注;13批銀黃片見表2。甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1皂苷初產(chǎn)物的蒸發(fā)光散射法檢測色譜柱:C18(4.6mm×250mm,5μm),流動相:乙腈(A)、0.4%醋酸溶液(B)梯度洗脫(見表1)。蒸發(fā)光散射檢測器檢測;理論板數(shù)按灰氈毛忍冬皂苷乙峰計算應(yīng)不低于5000。進樣量:20μL。2.2對照溶液的制備精密稱取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品5.82mg,加50%甲醇溶解并稀釋至50mL,搖勻,即得。2.3試驗溶液的制備2.3.1超聲處理法取藥材粉末約0.5g,精密稱定,置50mL量瓶中,加50%甲醇適量,超聲處理30min,放冷,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。2.3.2超聲處理法取約0.1g,精密稱定,置100mL量瓶中,加50%甲醇適量,超聲處理30min,放冷,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。2.3.3超聲處理法取約0.2g,精密稱定,置50mL量瓶中,加50%甲醇適量,超聲處理30min,放冷,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,即得。2.4方法研究2.4.1儀器準確度測試取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品溶液,連續(xù)進樣6次,測其峰面積,取對數(shù),計算RSD值為0.33%,表明儀器精密度良好。2.4.2保護時間的穩(wěn)定性取供試品溶液,每隔4h進樣一次,測定36h內(nèi)色譜峰的保留時間,計算RSD值為0.15%,表明供試品溶液保留時間的穩(wěn)定性良好。2.4.3檢測限和定量限分別配制一個較低濃度的灰氈毛忍冬皂苷乙對照品溶液,注入液相色譜儀,觀察其峰高與基線噪音的比值(即性噪比S/N),當S/N等于3時,此時的濃度為檢測限(LOD)?；覛置潭碥找业腖OD為8.31×10-3mg·mL-1。2.4.4銀黃片及提取物的制備分別取灰氈毛忍冬皂苷乙對照、以山銀花提取物投料的銀黃片和金銀花提取物投料的銀黃片,按上述方法進行測定,見圖1。結(jié)果說明上述檢測方法可以區(qū)分銀黃片樣品的金銀花和山銀花的投料情況。2.4.5色譜柱的選擇按上述確定的色譜條件,選擇ThermoBDS、依利特HypersilBDS和Diamonsil(2)色譜柱進行不同色譜柱的耐用性考察。結(jié)果表明選擇該流動相測定灰氈毛忍冬皂苷乙,對色譜柱選擇性不強,適用范圍廣。2.5木材測試取收集的2批金銀花對照藥材、11批不同產(chǎn)地的金銀花藥材、4批山銀花藥材和2批細氈毛忍冬藥材,分別按上述方法進行測定,結(jié)果見圖2。2.6提取物的制備和測試2.6.1金銀花提取物和山銀花提取物的制備分別取金銀花和山銀花藥材,加水煎煮3次,第一次加水10倍量煎煮1h,第二次加水8倍量煎煮1h,第三次加6倍量水煎煮0.5h,濾過,合并3次煎煮液,減壓濃縮至相對密度1.13~1.18(70℃)的清膏,加適量淀粉,攪拌均勻,干燥,即得到金銀花提取物和山銀花提取物。2.6.2灰氈毛忍冬皂苷乙對自制的兩批金銀花提取物和山銀花提取物進行測定,結(jié)果金銀花提取物未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙,而山銀花提取物檢出。對市場中收采的21批金銀花提取物進行測定,結(jié)果5批金銀花提取物檢出灰氈毛忍冬皂苷乙,存在摻加山銀花投料制備提取物的現(xiàn)象。2.7樣品測定3種衣劑和試藥的檢測3.12批金銀花對照藥材和不同產(chǎn)地的11批金銀花藥材均未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙,4批山銀花藥材和2批細氈毛忍冬藥材檢出。說明金銀花藥材不含灰氈毛忍冬皂苷乙,其可以作為金銀花和山銀花區(qū)別的特征成分。3.2按同種工藝制備的金銀花提取物未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙,而山銀花提取物檢出。說明山銀花藥材制備得到提取物,其特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙仍然保留,可作為區(qū)分金銀花提取物和山銀花提取物的特征成分。3.39家企業(yè)提供的13批銀黃片中有5批檢出為山銀花投料,說明目前生產(chǎn)銀黃制劑的部分廠家考慮到市場上金銀花與山銀花的價格差異,為節(jié)約成本改用山銀花投料,這勢必對一些正規(guī)按