病理制片技術(shù)手冊

病理制片技術(shù)手冊第一章病理標(biāo)本的接受

第二章組織固定

第三章取材

第四章組織脫水

第五章包埋

第六章組織石蠟切片

第七章常規(guī)染色

第八章封片

第九章冷凍切片的制作

第十章常用特殊染色

第十一章常用試劑及染液的配制第一章病理標(biāo)本的接受

病理標(biāo)本的接受是在取材、固定組織前首先要做的第一步工作，它是臨床與病理科交接的一種重要環(huán)節(jié)，它為開展病理學(xué)檢查、病理檔案的保留奠定了基礎(chǔ)。

標(biāo)本接受程序如下。

1．首先查對病理申請單與標(biāo)本上的紅色號碼與否一致。

2．核查病理申請單上寫明的送檢標(biāo)本及數(shù)目與否與實際送檢標(biāo)本一致。

3．觀測送檢標(biāo)本的大小及固定液比例與否合適。

(1)穿刺活檢及纖支鏡所取的小標(biāo)本，4％中性甲醛(10％中性福爾馬林)固定組織的量應(yīng)在6～10倍。

(2)對于較大的手術(shù)切除標(biāo)本，應(yīng)及時切開固定；查對后將病理申請單和標(biāo)本編上病理標(biāo)本號。

4．將病人姓名、性別、年齡、病歷號、科別、臨床診斷、部位、標(biāo)本來源、標(biāo)本例數(shù)等逐項錄入電腦存儲。

5．作為病理資料不僅要做好計算機(jī)錄入工作，還須進(jìn)行文字登記，以便病理檔案長期保留。

第二章組織固定

一、固定的目的和意義

活體組織一旦停止血液循環(huán)和物質(zhì)代謝就會因物質(zhì)代謝障礙產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)和組織化學(xué)變化，并導(dǎo)致形態(tài)學(xué)上可見的細(xì)胞器變化和細(xì)胞組織的形態(tài)變化直至腐敗自溶。固定的目的就是要通過使用化學(xué)和物理的措施，盡量地保留組織細(xì)胞離體時具有的生理和病理形態(tài)構(gòu)造及生物化學(xué)和免疫化學(xué)成分。

良好的固定是制作優(yōu)秀病理切片的基礎(chǔ)，也是特殊染色、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)和組織原位分子雜交等技術(shù)措施賴以成功的基礎(chǔ)。

因此，在病理技術(shù)工作中必須高度重視固定的質(zhì)量。

二、組織固定的注意事項

1．及時取材：由于甲醛對組織的平均穿透速度只有0.8mm/h，因此手術(shù)切除的送檢標(biāo)本應(yīng)及時切開進(jìn)行取材，以便保證重要的鏡檢部位能及時地得到固定。

2．及時固定：完畢取材的組織塊應(yīng)立即投入固定液以便盡量地保留組織細(xì)胞的形態(tài)構(gòu)造和抗原性。

3．液量充足：一般狀況下規(guī)定固定液的量應(yīng)為組織體積的6～10倍。

4．適度固定：現(xiàn)代固定的規(guī)定是，在良好保留組織細(xì)胞形態(tài)構(gòu)造的同步盡量很好地保留組織細(xì)胞的抗原性。長時間的固定會導(dǎo)致某些組織抗原性的逐漸喪失，因此，適時固定可以在保留細(xì)胞構(gòu)造和抗原性之間獲得必要的平衡。對于較大的送檢標(biāo)本而言，在及時切開固定的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡量在24h以內(nèi)取材進(jìn)入組織脫水程序。

5．合適溫度：低溫可以減少固定的速度，反之可以加緊固定進(jìn)程。在自動組織脫水機(jī)上可以施加恒定的溫度使得在有限的時間內(nèi)可以完畢固定過程。一般狀況下應(yīng)將固定溫度控制在36~38℃。

6．合適攪拌：在自動組織脫水機(jī)上可以通過使用攪拌和試劑循環(huán)功能使固定過程在標(biāo)本與試劑充足接觸的條件下完畢。

三、固定液的選擇

影響標(biāo)本固定的原因諸多，如組織與固定液的比例、固定期間、固定溫度等；除此之外，固定液自身也很重要，若所選固定液不妥，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類、核酸等成分將會有不一樣程度地?fù)p失。固定劑最佳隨配隨用，并注意其濃度和酸堿度。因此根據(jù)實際工作的目的，選用合適的固定液非常重要。下面是某些常用固定液的配制措施及合用范圍。

1．單純固定液

(1)4％中性甲醛固定液：最常用的固定液，能滿足常規(guī)HE及免疫組化、PCR等工作。一般無特殊規(guī)定的病理標(biāo)本均合用。尤其值得注意的是，中性甲醛是以pH7．2～7．4的磷酸緩沖液為溶劑配制的，其固定效果及對組織抗原性的保留均優(yōu)于一般的4％甲醛固定液。此固定液配制后應(yīng)密封并保留在陰涼處，保留時間不超過一種月。

甲醛(40%)100ml

無水磷酸氫二鈉6.5g

磷酸二氫鈉4.0g

蒸餾水900ml

(2)乙醇固定液：使用時以80％～95％的濃度為宜，具有硬化、固定、脫水等作用，對組織滲透力較弱，因此很少單獨使用，但其保留組織中的核酸強(qiáng)于中性甲醛，故常用于有核酸操作的試驗或檢查，假如用于證明尿酸結(jié)晶和保留糖原，可用100%乙醇固定組織。

(3)4％的多聚甲醛：重要用于培養(yǎng)細(xì)胞的固定。

2．混合固定液

(1)乙醇一甲醛(乙醇－福爾馬林，AF)固定液：合用于皮下組織中肥大細(xì)胞的固定。該固定液有固定兼脫水作用，固定后的標(biāo)本可直接入95％乙醇脫水。

甲醛(40％)100ml

95％乙醇900ml

(2)B5(醋酸鈉一升汞一甲醛)固定液：多用于固定淋巴組織。染色前應(yīng)進(jìn)行脫汞沉淀處理。

無水醋酸鈉1.25g

升汞6.0g

蒸餾水90ml

使用前加入甲醛10ml

(3)Bouin固定液：尤其合用于睪丸活檢組織的固定。Bouin液對組織固定較均勻，收縮很少，不會使組織變硬變脆。需現(xiàn)配現(xiàn)用。

飽和苦味酸水溶液(約1.22%)75ml

甲醛25ml

冰醋酸5ml

(4)Carnoy固定液：穿透能力強(qiáng)，可很好的固定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，尤其適合于固定外膜致密的組織，亦合用于糖原及尼氏小體的固定。

無水乙醇60ml

氯仿30ml

冰醋酸10ml

(5)Zenker固定液：經(jīng)此液固定的標(biāo)本，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色頗為清晰，但成本較昂貴且需特殊處理汞。該固定液要防止接觸陽光，以免引起化學(xué)變化而失效。

升汞5.0g

重鉻酸鉀2.5g

硫酸鈉1.0g

蒸餾水(加至)100ml

四、操作措施

臨床醫(yī)師切取標(biāo)本后，應(yīng)盡快將標(biāo)本置于盛有足夠量固定液的容器內(nèi)，盡量防止也許出現(xiàn)固定不及時或不充足導(dǎo)致標(biāo)本干涸或腐敗，無法進(jìn)行切片制作。病理科工作人員驗收標(biāo)本后，必須對臨床初步固定的標(biāo)本及時進(jìn)行規(guī)范的處理：對于穿刺及胃腸鏡所取的小標(biāo)本，直接添加中性甲醛，添加的量應(yīng)6～10倍于標(biāo)本體積；對于較大的手術(shù)切除標(biāo)本應(yīng)呈書頁狀切開、有包膜的標(biāo)本切開固定，切開的厚度1cm左右，為了保留標(biāo)本的原有大體形態(tài)，切開時最佳不要完全斷開，兩切面之間用脫脂棉或紗布隔開，然后放人6～10倍體積的固定液中完全沉沒。特殊標(biāo)本特殊處理：如脾臟或淋巴結(jié)等包膜較厚，固定劑滲透力有限，應(yīng)切薄薄的一小片單獨固定，對于宮頸錐切標(biāo)本及胃腸等空腔器官應(yīng)及時釘板展開固定。固定到取材的時間應(yīng)視標(biāo)本的大小及切面的厚度而定，小標(biāo)本應(yīng)不少于4h,大標(biāo)本不少于18h。

第三章取材

一、概念

取材是將送檢標(biāo)本進(jìn)行客觀描述并將病變部位組織切成厚薄適度的小片后裝入小盒(進(jìn)入組織脫水程序)，取材至關(guān)重要。

二、取材環(huán)境

取材室由取材臺、記錄桌、標(biāo)本陳列架、電腦查詢等構(gòu)成；取材臺應(yīng)有良好的排風(fēng)、進(jìn)出水系統(tǒng)，配置齊全的刀、剪、鑷、尺等基本工具和備用固定劑，記錄桌應(yīng)備有打號機(jī)(無時應(yīng)用鉛筆)、記錄紙張、標(biāo)本小盒及盒蓋等，標(biāo)本陳列架應(yīng)寄存、拿取以便、排風(fēng)良好，電腦查詢應(yīng)與登記臺和醫(yī)師診斷記錄成果的計算機(jī)相連。

三、操作

1．首先進(jìn)行查對：記錄者拿出一份申請并唱出病理號，取材醫(yī)師按病理號拿出一份標(biāo)本，查對無誤后唱出申請單編號，記錄者查對無誤后念出申請單上填寫的取材部位和送檢標(biāo)本份數(shù)及詳細(xì)塊數(shù)，取材醫(yī)師查對無誤后對標(biāo)本進(jìn)行詳細(xì)描述。

2．對送檢標(biāo)本的觀測和描述：可分為活檢小標(biāo)本(包括經(jīng)內(nèi)窺鏡獲取的黏膜組織、淺表或深在部位的穿刺物、子宮腔刮取物、經(jīng)微創(chuàng)手術(shù)由器官或腫瘤中切取的不完整組織等)和手術(shù)大標(biāo)本。

(1)小標(biāo)本檢查：描述送檢標(biāo)本的數(shù)量(量少時精確計數(shù))、大小(量少時精確測量，量多時聚堆測量體積)、色澤、形狀以及質(zhì)地等。

(2)大標(biāo)本檢查：①檢查切除標(biāo)本的手術(shù)類型。②測量標(biāo)本的大??；描述標(biāo)本的形狀、色澤、有無包膜或被膜及質(zhì)地，必要時(如內(nèi)分泌腫瘤)要在切開標(biāo)本前稱重；帶有臟器的標(biāo)本還應(yīng)注意檢查病變與有關(guān)臟器的比鄰關(guān)系。③按操作規(guī)范切開檢查標(biāo)本切面，如實性區(qū)

域觀測色澤、質(zhì)地、紋理、有無出血壞死以及腫瘤肉眼浸潤深度和范圍；囊性區(qū)域觀測囊腫壁的厚度、內(nèi)外表面、內(nèi)容物及其性狀等。④注意各系統(tǒng)臟器大體檢查的特殊規(guī)定。⑤必要時繪制簡圖闡明標(biāo)本大體特點和解剖關(guān)系，也可進(jìn)行表面及剖面攝影，以保留大體資料。

3．組織取材：按病理診斷和研究的目的和規(guī)定，從標(biāo)本上切取合適大小和數(shù)目的組織塊，供后續(xù)制片和顯微鏡下觀測用于診斷以及有關(guān)研究。取材的一般原則如下。

(1)認(rèn)真地進(jìn)行大體檢查，精確選用病變部位。

(2)顯示病變?nèi)?，切取有代表性的病變區(qū)域組織，包括病變周圍相對正常的組織和壞死組織等；對有腫瘤的標(biāo)本應(yīng)包括切緣、腫瘤包膜及轉(zhuǎn)移部位等。

(3)組織塊的面積一般為2.0cmX1.5cm，厚度不超過3.0mm。太大太厚的組織塊常會固定不充足，而影響脫水和制片。組織塊的數(shù)量依詳細(xì)狀況而定，一般以滿足診斷和有關(guān)研究需要為準(zhǔn)。

(4)骨或鈣化組織需要先經(jīng)脫鈣處理；腔道器官及囊壁組織應(yīng)立埋。

4．記錄：大體檢查和取材要由具有一定經(jīng)驗的病理醫(yī)師進(jìn)行，應(yīng)配置人員進(jìn)行記錄。記錄人員負(fù)責(zé)如下事宜。

(1)每例標(biāo)本在病理醫(yī)師進(jìn)行大體檢查和取材前，與其共同查對該例標(biāo)本份數(shù)、內(nèi)容、病變特性及其標(biāo)志與否與申請單有關(guān)內(nèi)容一致。

(2)病理醫(yī)師在進(jìn)行大體檢查和取材時，記錄人員根據(jù)申請單向醫(yī)師匯報病人基本狀況、術(shù)中所見、送檢醫(yī)師特殊規(guī)定等，并如實清晰地將病理醫(yī)師口頭描述記錄于記錄單上，必要時繪制簡圖顯示大體所見及標(biāo)示取材部位。

(3)病理醫(yī)師取材完畢后，與其共同核算取材內(nèi)容，保證組織塊及其編號標(biāo)簽精確置人脫水盒內(nèi)，并在記錄單和取材工作單上簽名并簽訂日期。

5．注意事項

(1)查對要認(rèn)真，描述要客觀，取材要精確。

(2)每例標(biāo)本取材前后，均應(yīng)用流水徹底清洗取材臺面和所有有關(guān)器物，防止交叉污染。

(3)細(xì)小標(biāo)本取材時可用伊紅點染并用濾紙包裹，嚴(yán)防標(biāo)本丟失。

(4)大標(biāo)本取材大小要合適(組織塊的面積一般為2.0cm×1.5cm，厚度不超過3.0mm)

(5)取材刀刃要鋒利，防止使用鈍刀或齒鑷過度擠壓組織，取材動作要輕柔，不可來回切割或過度牽拉組織，以免組織構(gòu)造變形或內(nèi)部細(xì)胞脫落。

(6)組織塊切面應(yīng)平整，如有線結(jié)和鋼絲應(yīng)拔除。

(7)所取組織應(yīng)包括各臟器的重要構(gòu)造或全層。

(8)特殊標(biāo)本要在取材前攝影留資料。第四章組織脫水

組織經(jīng)固定后會有大量水分，組織脫水是用某些溶劑逐漸將組織內(nèi)的水分置換出來，以利于透明劑和石蠟的滲透。

一、手工脫水

1．器械準(zhǔn)備：大標(biāo)本缸6個，浸蠟用金屬缸3個，脫水籃，恒溫烤箱。

2．平常工作程序見表5．1。

表5．1手工脫水平常工作程序試劑濃度／溫度時間設(shè)定中性緩沖甲醛4%3.00h乙醇80%1.00h乙醇90%1.00h乙醇95%過夜無水乙醇I

2.00h無水乙醇Ⅱ

2.00h二甲苯一無水乙醇體積比為1:130min二甲苯I

30min二甲苯Ⅱ

1.00h石蠟60℃1.00h石蠟60℃1.00h石蠟60℃1.00h

3．注意事項

(1)所用標(biāo)本缸要大某些，到達(dá)組織塊與液體比6～10倍。

(2)固定液、脫水劑要勤更換，可以采用前移更換。

(3)二甲苯時間不適宜過長，不要超過2h。

(4)石蠟溫度不得高于60℃。

(5)所有程序應(yīng)每間隔0．5h搖動2～3次以利于固定脫水浸蠟徹底。

二、半自動脫水機(jī)

半自動脫水機(jī)平常工作程序可參照全手工脫水平常工作程序進(jìn)行。梯度乙醇的脫水時間加長。注意事項同手工脫水。

三、全自動密閉式脫水機(jī)

全自動密閉式脫水機(jī)有控制面板、處理槽、石蠟箱和試劑柜四個部分。為保證組織處理無刺激味道，全自動密閉式脫水機(jī)還設(shè)有活性炭過濾器。

(1)控制面板有顯示屏和小鍵盤，可由此輸入20個不一樣的處理程序，可設(shè)置處理時間和溫度，可啟動P／V循環(huán)(壓力和真空交替)和混合循環(huán)，出現(xiàn)故障時有報警提醒。

(2)處理槽是組織塊進(jìn)行處理的容器。

(3)石蠟箱可將熔化的石蠟保持在設(shè)定的溫度待用。

(4)試劑柜裝有處理試劑。

1．平常工作程序見表5．2。

表5．2全自動密閉式脫水機(jī)脫水平常工作程序溶液百分濃度

（％）時間設(shè)定溫度

（℃）P/V循環(huán)（壓力和真空交替）混合循環(huán)中性緩沖甲醛液42.00h35＋＋乙醇801.00h

－－乙醇951.00h

－－乙醇951.00h

＋＋乙醇951.00h

＋＋乙醇1001.00h

－－乙醇1001.00h

＋＋乙醇1001.00h

＋＋二甲苯1000.50h

－－二甲苯1001.00h

＋＋石蠟

1.00h60－—石蠟

1.00h60＋＋石蠟

1.00h60＋＋石蠟

1.00h60＋＋

注：截止時間為1／8：00am

2．雙休日工作程序：脫水程序及各試劑的所用時間及功能相似，只將截止時間調(diào)至3/8:00am即可。

3．外檢小標(biāo)本工作程序見表5．3。

表5．3全自動密閉式脫水機(jī)外檢小標(biāo)本工作程序試劑百分濃度

（％）時間設(shè)定溫度

（℃）P/V循環(huán)（壓力和真空交替）混合循環(huán)中性甲醛42.00h35＋＋乙醇801.00h

－－乙醇951.00h

－－乙醇951.00h

－－乙醇951.00h

＋＋乙醇10030min

－－乙醇10030min

－－乙醇10030min

＋＋二甲苯10020min

－－二甲苯10020min

＋＋石蠟

30min60－—石蠟

30min60－－石蠟

1.00h60＋＋石蠟

1.00h60＋＋

注：截止時間為1／8：00am

4．小動物組織工作程序見表5．4。

表5．4全自動密閉式脫水機(jī)小動物組織工作程序溶液百分濃度

（％）時間設(shè)定溫度

（℃）P/V循環(huán)（壓力和真空交替）混合循環(huán)中性甲醛42.00h35＋＋乙醇800.50h

－－乙醇950.50h

－－乙醇950.50h

＋＋乙醇950.50h

＋＋乙醇1000.50h

－－乙醇1000.50h

－－乙醇1001.00h

＋＋二甲苯10020min

－－二甲苯10020min

＋＋石蠟

0.50h60－—石蠟

0.50h60＋＋石蠟

1.00h60－－石蠟

1.00h60＋＋

5．大動物組織(如狗、兔、猴)：可以同外檢組織使用一種程序。

6．脫水程序運行完畢后處理。

(1)先按泵出按鈕將石蠟抽回缸內(nèi)，再打開處理槽將組織塊取出。

(2)將處理槽內(nèi)及槽蓋上的余蠟擦凈。

(3)將底部中央過濾器螺絲擰開，將管道口的蠟擦凈，擰緊螺絲。

(4)蓋上蓋后，按清洗按鈕清洗。

7．全自動密閉式脫水機(jī)的注意事項。

(1)固定液每三天更換一次，組織塊為600～800塊。組織固定的好壞直接影響切片質(zhì)量。為到達(dá)組織固定徹底的目的，可使用脫水機(jī)的P／V循環(huán)和混合循環(huán)功能，也可將溫度定在38～40℃。

(2)梯度乙醇脫水劑每星期更換一次，組織塊約為1000～1200塊。措施是將第二缸的80％乙醇倒棄，后來的95％乙醇和無水乙醇依次前移。只將最終一缸的無水乙醇更換為新液。這樣更換不僅節(jié)省了乙醇，更重要的是假如脫水劑所有更換為新液就會產(chǎn)生過脫水，組織發(fā)脆。通過幾次脫水后的乙醇，濃度雖然只減少了5％～10％，但脫水過程中置換出的細(xì)胞外液、組織液等可減弱乙醇的脫水能力。因此實際工作過程中須根據(jù)組織塊的多少、脫水劑的使用時間合理設(shè)定脫水劑的脫水時間、P／V循環(huán)和混合循環(huán)功能。

(3)透明劑二甲苯10～15天更換一次。第一缸二甲苯倒棄，第二缸前移至第一缸，第二缸更換為新液。二甲苯起媒介作用，將無水乙醇置換出又使石蠟很好地浸入組織內(nèi)。假如透明時間過長、強(qiáng)度過大(如P／V循環(huán)和混合循環(huán)全程使用)就會產(chǎn)生透明，以致組織發(fā)脆發(fā)干不利于切片。因此透明劑設(shè)定的時間、P／V循環(huán)和混合循環(huán)的使用要有機(jī)配合。

(4)所用石蠟要潔凈無雜質(zhì)，熔點58～60℃。使用一定期間后，倒棄二甲苯含量過高的第一缸石蠟，將后三缸石蠟依次前移，最終一缸換新鮮石蠟。石蠟溫度設(shè)定為60℃，這樣的溫度可防止小標(biāo)本浸蠟因溫度過高而發(fā)脆。

(5)脫水機(jī)要放置干燥通風(fēng)房間，防止陽光直射顯示屏。最佳配置一臺不間斷電源(UPS)，防止瞬間斷電影響機(jī)器使用。

(6)使用全自動密閉式脫水機(jī)要防止過脫水，過透明。

第五章包埋

一、意義

組織塊通過固定、脫水、透明、浸蠟等處理后，用包埋劑(如石蠟、樹脂、塑料等)將其包制成含組織塊的蠟塊或塑料塊等的過程稱為包埋。不一樣的包埋措施有不一樣的規(guī)定，經(jīng)包埋后，組織可到達(dá)一定的硬度和韌度，有助于切成理想的薄片。

二、包埋環(huán)節(jié)

先將熔化的石蠟注入包埋托內(nèi)(模具)，而后用鑷子將通過浸蠟的組織塊從脫水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷臺上，用鑷子輕按組織塊，以到達(dá)組織塊平整，蓋上脫水盒底，再加好石蠟，移至冷凍臺上，待冷凍好后，卸下組織蠟塊待切。包埋時應(yīng)根據(jù)組織的不一樣，選擇大小型號適合的包埋托；有規(guī)定直立包埋的組織要用鑷子將組織固定在蠟塊中央稍停半晌，以使組織在蠟?zāi)龝r立住，到達(dá)立埋的規(guī)定。

三、注意事項

1．每次夾取組織塊時，鑷子用乙醇燈加熱至溫度適中。

2．包埋托內(nèi)不要有水、碎蠟等異物，以免影響包埋質(zhì)量。

3．包埋蠟的溫度要控制好，包埋蠟的熔點應(yīng)為58~60℃。

4．包埋蠟加入少許蜂蠟(蜜蠟)，可以增長韌度，利于切片。

5．夾取組織塊放人包埋托內(nèi)時，一定要注意包埋面。

6．包埋好的蠟塊，用刀修整時，一定要合適保留蠟塊中組織周圍的白蠟邊，以利于持續(xù)切片。

7．每包埋完一塊組織，鑷子必須擦潔凈或用乙醇燈燒。

四、自動包埋機(jī)簡介

自動包埋機(jī)是對組織經(jīng)脫水、浸蠟后進(jìn)行包埋處理的設(shè)備。有多種類型，其設(shè)計具有人性化，一般整機(jī)由包埋部分和冷凍部分組合而成(一體化簡潔緊湊)，全自動程序控制，具有延時自動開機(jī)功能，加熱迅速，溫控精確，安全可靠，包埋效果好等特點，冷臺最低溫度可達(dá)一5℃，可進(jìn)行迅速冷凍處理包埋塊，具有大冷臺，冷凍面積大，可放置超大包埋盒或多種包埋盒。包埋部分溫度可以從55～70℃，可儲存3～5L石蠟，自動熔解石蠟，可容納70～100個樣品包埋盒。金屬板表面輕易清洗，有2個加熱的抽屜，可搜集多出的石蠟，進(jìn)行重新運用，防止石蠟揮霍。具有冷卻鑷子架，以便使用?？膳浞糯箸R利于小活檢標(biāo)本的包埋；可配腳踏：石蠟注入由腳踏開關(guān)控制或上手工控制。所有溫度和工作時間參數(shù)所有由程序控制，記憶功能配有備用電池，這使病理組織學(xué)試驗室的工作更為靈活。這種獨特的結(jié)合使目前組織學(xué)和病理組織學(xué)試驗包埋技術(shù)到達(dá)了新的水平。是創(chuàng)新發(fā)展的石蠟包埋技術(shù)和智能化高水準(zhǔn)工藝的完美結(jié)合。

第六章組織石蠟切片

組織經(jīng)石蠟包埋后制成的蠟塊，用切片機(jī)制成切片的過程為石蠟切片法。石蠟切片法現(xiàn)使用的切片機(jī)有平推式切片機(jī)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)兩種。

一、平推式切片機(jī)石蠟切片法

1．切片前的準(zhǔn)備：清洗過的載物片(或免清洗的)，毛筆，鉛筆，小竹片，水槽，霧化器，攤片器，切片刀，刀架。

2．切片制作環(huán)節(jié)：刀架的粗削部放在頭端，在切片機(jī)刀架部夾緊。組織蠟塊裝在切片機(jī)蠟塊固定器上夾緊。右手握切片機(jī)刀頭運動手柄，左手轉(zhuǎn)動切片機(jī)蠟塊運動旋鈕。先轉(zhuǎn)動此鈕，后平拉刀架運動手柄，進(jìn)行粗削，直至組織切全。停止，將刀架移到細(xì)削部，輕輕轉(zhuǎn)動蠟塊運動旋鈕，后拉刀架手柄進(jìn)行細(xì)削。削至組織光滑發(fā)亮，右手拿毛筆掃凈刀架及蠟塊上的蠟屑，組織屑，放下毛筆，再用右手握住刀架運動手柄。左手拿小竹片，用竹片頭蘸一下水槽中的水。左手中指搬動薄切鈕，霧化器的噴頭對準(zhǔn)蠟塊。右手拉刀架運動手柄。左手中的小竹片在蠟塊空白處等待切片刀切起蠟片一端挑起粘住，隨切片刀移動，完整的蠟片切出后，粘在竹片上，移入水槽中，撈片，放在攤片器上攤片5min后，裝在染色籃上，放入75℃烤箱烤片。

3．注意事項

(1)無冷臺的病理科可以將包埋好的組織蠟塊放到冰箱內(nèi)，但如放置時間過久溫度太低切片時蠟塊會產(chǎn)生熱漲，切片會厚，要多切幾張，背面的片子就會薄某些。

(2)霧化器是清除靜電的，但也有增長切片厚度的缺陷。尤其霧氣大時，使蠟塊熱漲，厚度增長更明顯。為了保證切片厚度，一定要控制好風(fēng)力、霧力。霧化器使用自來水，水位控制在30刻度。

(3)切片機(jī)使用前一定要檢查各部位狀況。先檢查固定器與否固定在你所要的厚度上。切片機(jī)刀架角度與蠟塊呈90。。從蠟塊右上角進(jìn)刀。

二、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)石蠟切片法

1．切片前的準(zhǔn)備：清洗過的載玻片、毛筆、鉛筆、盛有30％乙醇的小燒杯、牙科鑷、展片槽、切片機(jī)、一次性刀片及刀架。檢查輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片厚度的鈕與否固定于你所要切的厚度刻度上。

2．切片制作環(huán)節(jié)：將放在－5℃冷臺上的組織蠟塊裝在切片機(jī)固定器上夾緊，空白蠟多的一端在上。將切片刀固定一端為粗削部，左手旋動蠟塊推進(jìn)器，右手旋動切片機(jī)把手。先搖動蠟塊推進(jìn)器，后搖動切片機(jī)機(jī)頭半輪上下運動，進(jìn)行粗削，一進(jìn)一削，直至組織切全。而后將切片刀移至另一端進(jìn)行細(xì)削，削至蠟塊光滑平整。用毛筆將其刀架、蠟塊面打掃潔凈。左手持毛筆，右手整輪轉(zhuǎn)動切片機(jī)手柄進(jìn)行切片。將毛筆貼于刀架背不時轉(zhuǎn)動，輕輕托起連片的蠟片。右手停止轉(zhuǎn)動機(jī)頭，換持牙科鑷，夾住連片蠟片頭端，放入盛30％乙醇的燒杯內(nèi)。用牙科鑷清除不好的蠟片。放入水溫45～50℃水槽內(nèi)展片后撈片。

3．注意事項

(1)無冷臺的病理科可以將包埋好的組織蠟塊放到冰箱內(nèi)，但如放置時間久溫度太低注意切片時蠟塊會產(chǎn)生熱漲，切片會厚，要多切幾張，背面的片子就會薄某些。

(2)為了可以連片，蠟塊兩端要有空白蠟。多的一端放在上面。

(3)展片槽溫度不要過高，有時會有小組織塊散漂在水面上導(dǎo)致污染?？捎檬旨堈鄢膳c水槽寬度相似水面行走，將組織屑撈走。第七章常規(guī)染色

蘇木精(hematoxylin)和伊(eosin)染色措施，簡稱HE染色措施，是生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)最廣泛應(yīng)用的染色措施。在病理科稱為常規(guī)染色措施。病理學(xué)的診斷都是以HE措施為基礎(chǔ)的。染色的目的是把組織切片或細(xì)胞涂片等浸入染料及其他染色劑配成的染色液中，通過合適的時間和處理，使組織或細(xì)胞及其他成分染上不一樣深淺的顏色，產(chǎn)生不一樣的折射率，從而便于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀測和研究。

進(jìn)行染色前進(jìn)行染色液的配制，應(yīng)根據(jù)工作量的多少配制對應(yīng)量的染液，同步應(yīng)注意溶液種類的選擇、溶液濃度、pH值等，此外也應(yīng)注意配方的合理選擇。

在實際工作中，應(yīng)做到如下幾點。

(1)保持染液的清潔，應(yīng)常常過濾或更換。

(2)染色時間應(yīng)根據(jù)組織的種類、染液的新舊及特殊規(guī)定而決定。

(3)染色環(huán)境溫度對染色效果也有著親密的影響，故染色時間必須根據(jù)不一樣條件靈活掌握。

(4)脫蠟潔凈與否對染色效果有著重要影響，烤片溫度、脫蠟二甲苯的溫度、二甲苯的新舊和二甲苯脫蠟的時間長短都與染色有著親密關(guān)聯(lián)。

(5)標(biāo)本脫水的好壞及固定的充足與否對染色效果影響極大。

(6)切片染色后，經(jīng)梯度乙醇脫水，若每步的時間局限性易導(dǎo)致切片發(fā)霧、模糊不清，影響診斷。

在染色過程中，既要按常規(guī)措施環(huán)節(jié)進(jìn)行操作，也應(yīng)根據(jù)實際狀況、個人經(jīng)驗靈活運用，不?？偨Y(jié)，才能純熟掌握并提高實際工作能力與效率。

一、人工染色

人工染色已使用近百年，至今還在使用，既古老又實用。人工染色的設(shè)置因地區(qū)的差異設(shè)置也不一樣，但大多數(shù)的地方基本同樣。

１．石蠟切片HE人工染色程序(見表8．1)。

表8．1人工染色程序液體設(shè)置１75℃恒溫烤箱烤片20min２二甲苯I2～5min３二甲苯Ⅱ2～5min４二甲苯Ⅲ2～5min５無水乙醇I1min６無水乙醇Ⅱ1min７95％乙醇I1min８95％乙醇Ⅱ1min９85%乙醇1min1080%乙醇1min1170%乙醇1min12自來水水洗3次，將水控凈13蘇木精?5min14自來水水洗3次15l％鹽酸乙醇分化3～5s16自來水水洗3次17O．5％氨水返藍(lán)18自來水水洗3次191％伊紅水溶液1min20自來水水洗3次2170%乙醇1min2280%乙醇1min2395%乙醇I1min2495%乙醇Ⅱ1min25無水乙醇I1min26無水乙醇Ⅱ1min27無水乙醇Ⅲ1min28二甲苯I1min29二甲苯Ⅱ1min30二甲苯Ⅲ擱置至封片

2．注意事項

(1)石蠟切片放入恒溫箱中烤片，溫度不可過低或過高，以75℃為宜，否則在染色過程中輕易發(fā)生脫片。

(2)組織切片脫蠟要經(jīng)二甲苯三次才能徹底。切片從恒溫箱取出后應(yīng)趁熱浸入二甲苯以利于徹底脫蠟。使用一段時間后，第一缸二甲苯融的蠟較多應(yīng)倒棄，其后的二甲苯依次前移，最終一缸換新鮮的二甲苯。

(3)切片經(jīng)70％乙醇后入蘇木精染液前，必須自來水水洗3次，最終1次最佳用蒸餾水水洗并控干。這樣可以保證Harris蘇木精染色能力持久，而不會由于低濃度乙醇的混合而過早的喪失染色能力。

(4)Harris蘇木精染液配制的好壞直接影響切片染色質(zhì)量。好的蘇木精染液500ml正常染色能力為2500張左右。為保證染色質(zhì)量應(yīng)及時更換染液。

(5)蘇木精染液要常常過濾以保證染色清潔而不在切片上有染色渣的出現(xiàn)。

(6)鹽酸乙醇分化液配制參見本書第十二章。分化時間可根據(jù)分化液的新舊合適調(diào)整，新的分化液時間短些。分化的目的就是讓該染上要清晰地染上，而不該著色的一定要分化掉。

(7)氨水返藍(lán)液濃度不可過高，返藍(lán)時間不可過高，不要過長，否則會發(fā)生脫片現(xiàn)象。

(8)1％伊紅水溶液是理想的胞漿染液。要選擇好水溶性的伊紅染料使胞質(zhì)鮮艷某些，切片不僅漂亮且利于觀片。

(9)切片染色后的脫水要充足，每道乙醇脫水的時間不要過短，尤其是三道無水乙醇更為如此。無水乙醇要勤更換。

(10)切片經(jīng)最終一次無水乙醇后盡快地放人二甲苯中。在夏季室內(nèi)濕度較大的環(huán)境中更是如此。如切片在濕度大的空氣中停留時間過長就會在封片時產(chǎn)生霧氣，而不能現(xiàn)片。其原因是無水乙醇吸取了空氣中的水汽，在二甲苯中難以分離析出，當(dāng)用中性樹膠封片后，二甲苯揮發(fā)，而水汽留在膠中產(chǎn)生霧氣。

(11)封片所使蓋玻片需大小合適、清潔。樹膠用量視蓋玻片大小而定，規(guī)定不發(fā)生溢膠或缺如。

(12)不倡導(dǎo)切片經(jīng)無水乙醇，然后干燥，直接用中性樹膠封固。這樣會產(chǎn)生人為的細(xì)小黑點，與細(xì)胞核相似。

(13)封片要在通風(fēng)廚中進(jìn)行，防止二甲苯污染工作間，危害技師的身體。

二、自動染色機(jī)

自動染色機(jī)是近幾年才引進(jìn)的病理自動儀器，在病理制片過程中發(fā)揮著重要的作用，它可以持續(xù)進(jìn)行染色，自動記憶，染色效果好，質(zhì)量控制到位。起到了手工無法比擬的作用。

1．液體設(shè)置：由于機(jī)器為電腦控制，染液次序及液體的設(shè)置根據(jù)染色機(jī)所設(shè)置的染色缸多少來調(diào)配。染色機(jī)基本模擬手工措施，運用機(jī)器手來完畢操作程序見表8．2。

表8．2機(jī)染程序的液體設(shè)置二甲苯二甲苯二甲苯無水乙醇無水乙醇95%乙醇85%

乙醇水水水水水烤箱65℃

停機(jī)報警取籃處二甲苯二甲苯二甲苯無水乙醇無水乙醇95%乙醇85%乙醇伊紅1%

氨水1%

鹽酸

乙醇蘇木精裝機(jī)

2．注意事項

(1)工作前先檢查染液及試劑，并啟動電源。

(2)啟動進(jìn)水開關(guān)。

(3)調(diào)試好所需的染色程序，根據(jù)蘇木精一伊紅的新舊來調(diào)整時間。

(4)將切片染色籃放人染色機(jī)后按提醒鍵即可按程序進(jìn)行染色。

(5)聽到提醒音響后，取出已染好的切片染色籃進(jìn)行封片。

(6)工作完畢后，關(guān)閉電源，關(guān)掉水源，并蓋好染色缸。

(7)染色機(jī)配制的無水乙醇及95％乙醇的程序比手工程序少，但不影響染色效果，因機(jī)械手在提高時有抖動作用，帶的液體很少。

(8)定期取出活性碳過濾網(wǎng)晾曬保證使用。

(9)工作結(jié)束后一定要取出鹽酸乙醇，以免長期放在機(jī)器內(nèi)，腐蝕機(jī)器。

第八章封片

封片是將組織切片封固保留于載玻片與蓋玻片之間，使之不與空氣發(fā)生接觸，防止其氧化、褪色，利于鏡檢觀測及保留。

一、手工封片

手工封片應(yīng)注意如下七點。

(1)所用樹膠濃度要適中，以一般速度滴下并恰能成珠既可。太稀時易溢出玻片，當(dāng)二甲苯揮發(fā)后，組織切片就會收縮產(chǎn)生膠不勻并出現(xiàn)大片氣泡。太濃時，滴在玻片上樹膠不易散開，易產(chǎn)生氣泡，難以驅(qū)除，并影響折光率。

(2)樹膠用量多少應(yīng)根據(jù)組織大小、厚薄而定。

(3)應(yīng)迅速敏捷滴膠。

(4)封片時，切片上應(yīng)保留合適的二甲苯，以防干封，產(chǎn)生氣泡。

(5)為防止氣泡，封片時，樹膠不適宜攪動。

(6)如遇有小氣泡時可用鑷子輕壓蓋玻片，排除氣泡。

(7)封片時，若離面部較近，鼻、口呼出的氣體會有水分導(dǎo)致切片云霧狀甚至模糊不清，需引起注意。

二、機(jī)器膠帶封片機(jī)

機(jī)器膠帶封片機(jī)不用樹膠，只用少許二甲苯即可封片。使用以便，切片診斷后即可歸檔，不會因樹膠不干導(dǎo)致粘片等。使用封片機(jī)時，首先檢查二甲苯瓶，并檢查滴液分注量，檢查膠帶可用量、選擇膠帶長短規(guī)格，檢查接片筐與否安裝到位。工作時開通電源，并打開過濾網(wǎng)開關(guān)。工作完畢后，關(guān)閉2個電源，擦拭機(jī)器。

三、機(jī)器蓋玻片封片機(jī)

機(jī)器蓋玻片封片機(jī)采用模擬人工手法來完畢封片工作。使用機(jī)器封片，封片效率高、質(zhì)量好，同步可減少封片對技術(shù)人員身體的傷害。其操作環(huán)節(jié)為如下。

(1)接通電源，打開開關(guān)，機(jī)器進(jìn)行白檢后，指示燈變綠即可工作。

(2)將染色完畢的染色籃精確的放人封片機(jī)內(nèi)。

(3)按動開始鍵，封片機(jī)進(jìn)入工作狀態(tài)。

(4)封片結(jié)束后報警，即可取出封好的切片。

機(jī)器蓋玻片封片機(jī)的蓋玻片采用24×40、24×50、24×60等規(guī)格的蓋片(目前國產(chǎn)免洗蓋玻片已替代進(jìn)口，使用效果良好)。

第九章冷凍切片的制作

一、概述冷凍切片是運用物理降溫的措施將新鮮的組織標(biāo)本冷凍使其產(chǎn)生一定的硬度進(jìn)行切片的技術(shù)措施。與石蠟切片相比，由于冷凍切片不需脫水包埋因此制片速度快，是為手術(shù)進(jìn)行中的臨床醫(yī)師提供病理診斷的良好措施。此外由于冷凍切片的標(biāo)本是未經(jīng)固定的新鮮組織，因此冷凍切片也是脂肪染色、酶組織化學(xué)染色以及某些免疫組織化學(xué)染色和原位分子雜交的理想制片措施。冷凍切片的局限性是組織細(xì)胞的形態(tài)略遜于石蠟切片。

二、冷凍切片的制作措施

運用氯乙烷噴灑、二氧化碳噴射、半導(dǎo)體制冷的措施均可制作一般的冷凍切片，用于術(shù)中的病理診斷。恒冷箱冷凍切片機(jī)可以制作合用于多種目地的冷凍切片，是目前最為常用的理想冷凍切片制片方式。

1.冷凍切片的技術(shù)操作措施

(1)將恒冷箱冷凍切片機(jī)的速凍頭和箱內(nèi)溫度調(diào)整到合適的切溫度，一般狀況下為一18～一25℃。

(2)在標(biāo)本冷凍托上涂布一層冷凍包埋劑一OCT，然后將取材后新鮮標(biāo)本安放在標(biāo)本冷凍托上并用OCT覆蓋標(biāo)本。

(3)標(biāo)本冷凍完畢后將標(biāo)本托固定在切片機(jī)的機(jī)頭上，調(diào)整機(jī)頭位置使其恰好位于切片刀的后方。

(4)使用粗切削方式進(jìn)行標(biāo)本的粗切削至暴露標(biāo)本的最大平面，使用自動推進(jìn)方式持續(xù)切削2～3刀后用毛筆清除機(jī)頭、標(biāo)本托及切片刀上的組織碎屑。

(5)調(diào)整并確認(rèn)切片的厚度，一般為4～8um，染脂肪和神經(jīng)組織應(yīng)控制在12~25um。

(6)放下防卷板使防卷板的位置恰好與切片刀的刀刃完全平行并略突出于刀刃。

(7)以自動推進(jìn)的方式進(jìn)行切片，良好的切片將在防卷板的下方形成一張完整平整的薄片，如切片略有彎曲可用小毛筆輕輕展平切片。

(8)打開防卷板，用載玻片平穩(wěn)地輕壓切片使其平整地吸附到載玻片上。

三、冷凍切片的染色

切好的冷凍切片立即投入丙酮中進(jìn)行固定，一般固定1～2min即可進(jìn)行染色，用于免疫組化染色的冷凍切片應(yīng)在切片略干時即刻投入冷甲醇中固定10~15rmin然后進(jìn)行對應(yīng)的組織化學(xué)染色程序。

1．冷凍切片的HE染色程序。

(1)切片在丙酮中固定1～2min。

(2)水洗5s。

(3)使用新鮮的Harris蘇木精染液染細(xì)胞核2min。

(4)水洗5s。

(5)在0.5％的鹽酸乙醇液中分化1～3s。

(6)水洗5s。

(7)在0.5％～1％的伊紅染液中染細(xì)胞質(zhì)20~30s。

(8)水洗5s。

(9)在95％乙醇I、95％乙醇Ⅱ、100％乙醇I、100％乙醇Ⅱ、中逐層脫水各3～5s。

(10)甲苯I、二甲苯Ⅱ透明各5s。

(11)干組織周圍的二甲苯，在二甲苯尚未干燥前滴加光學(xué)樹脂膠封片。

四、注意事項

1．倡導(dǎo)使用新鮮蘇木精染色液：高質(zhì)量的冷凍切片和良好的染色，是病理醫(yī)師為在手術(shù)中的外科醫(yī)師提供病理診斷的重要手段。為了在短時間內(nèi)獲得高質(zhì)量的HE染色冷凍切片，在保證高質(zhì)量冷凍切片的同步使用新鮮的蘇木精染色液是保證高質(zhì)量染色的重要前提。

2.防卷板的調(diào)整：對的地調(diào)整使用冷凍切片機(jī)的防卷曲板是獲得平展完整冷凍切片的重要手段，防卷曲板的對的位置是與切片刀

對的位置防卷曲板低于刀刃防卷曲板過于突出

的刀刃平行并略微突出于刀刃。如防卷曲板過度突出于刀刃會導(dǎo)致切片機(jī)頭上的組織與防卷曲板相撞，如防卷曲板低于刀刃會導(dǎo)致切片向上卷曲不能形成平整的切片。在調(diào)試時可從下向上逐漸提高防卷曲板的位置，每提高一點切一張切片測試，直至切片能在防卷曲板下形成完整平展的切片。

3.防止污染：切片污染是病理組織制片的大忌，在冷凍切片進(jìn)行粗切削完畢后必須用毛筆清理碎屑，以防止其他標(biāo)本的組織碎片沾染到正在進(jìn)行切片的標(biāo)本上。

4．不一樣組織的切片溫度調(diào)整：不一樣組織冷凍切片的冷凍溫度調(diào)整原則是，柔軟稚嫩富含水分的組織選擇相對較高的溫度，較為致密富含脂肪的組織選擇相對較低的溫度。柔軟稚嫩富含水分的組織選擇較低的溫度易導(dǎo)致切片呈碎屑狀，而致密富含脂肪的組織選擇較

高的溫度易導(dǎo)致切片堆積不能形成片狀。詳見表9·1。

表9．1部分組織冷凍切片的參照溫度值冷凍溫度組織一10～一15℃淋巴結(jié)、腎上腺、腦組織、脾臟、子宮內(nèi)膜、黏液軟骨－16～一25℃乳腺、肺、膽囊、子宮、小腸、結(jié)腸、腎、肝臟、肌肉、胰腺、前列腺、皮膚、甲狀腺、扁桃體、軟組織腫瘤一25～一50℃富于脂肪的乳腺組織、纖維脂肪組織、富于脂肪的皮膚組織、富于脂肪的腫瘤

第十章常用特殊染色

一、六胺銀染色

1．第一步準(zhǔn)備工作：配制六胺銀染液，將10％硝酸銀2．5ml倒入潔凈的染色缸內(nèi)，加入2％硼砂5ml，液體呈乳白色，再加入3％烏洛托品40ml，染液逐漸呈透明狀。

2．第二步染色過程：事先把溫箱調(diào)至60℃?zhèn)溆?，切片?jīng)脫蠟至水，用1％過碘酸氧化10min，水洗，然后切片放人六胺銀染液放置60℃溫箱1h，染真菌時間要相對短某些，一般狀況下肉眼看到染液變色，切片呈棕色時從溫箱取出染色缸，倒掉染液，自來水沖洗1min，用0．25％氯化金調(diào)色1min，水洗后，用3％硫代硫酸鈉染5min,水洗，用蘇木精染液淺染，水洗、分化、沖水返藍(lán)，伊紅染10s，最終經(jīng)脫水、透明、封固。

3．圖示成果：基底膜與毛細(xì)血管間質(zhì)性物質(zhì)、真菌呈棕黑色，核呈藍(lán)色。

4．注葸事項

(1)掌握染色溫度和時間，如60℃染1h，80℃染30～40min。

(2)真菌類染色時間相對要短，染色時間過長，切片染色過深，可用分色劑處理。

二、黏液卡紅染色

1．第一步準(zhǔn)備工作：配制黏卡染液，將稱好的胭脂1g、氫氧化鋁1g倒入瓶內(nèi)，加入50％L醇100rnl混合搖勻，再加入氯化鋁0．5g，水浴加溫逐漸煮沸并攪動液體，使其充足溶解(注意染液輕易外濺)，數(shù)分鐘后，染液由紅色變成透明深紫紅色，冷卻后將液體倒入量筒，再加入50％乙醇至原量，過濾，放人冰箱備用。

2．第二步染色措施：染液使用時原液與蒸餾水比例為1：4稀釋．

切片厚5um，脫蠟至水，經(jīng)蘇木精染色2min、水洗、分化、返藍(lán)后進(jìn)人黏卡液染色2h以上，染液可以反復(fù)使用多次，但要合適延長染色時間．切片水洗后，脫水、透明、封固。

3．圖示成果：黏液為紅色，胞核為藍(lán)色．

4．注意事項

(1)染液使用時比例為1份黏卡原液，4份蒸餾水。

(2)用酶消化對照染色特異性很大，消化時間為20min。

(3)配制黏卡染液時要防止液體濺出。

三、石碳酸品紅染色

1．第一步準(zhǔn)備工作

(1)配制鹽基性品紅飽和液：鹽基性品紅溶于乙醇