半夏、水半夏藥材成分測(cè)定及急性毒性比較研究

半夏、水半夏藥材成分測(cè)定及急性毒性比較研究

半夏是天南星科植物半夏的干燥部位。它溫暖、辣、有毒?？蓺w經(jīng)脾、胃、肺經(jīng)絡(luò)。除濕、去粘液，減少嘔吐，消除充血和結(jié)沙。水半夏為天南星科植物鞭檐犁頭尖[TyphoniumFlagelliforme(lodd.)Blume.]的干燥莖,性溫,味辛,有毒。具有燥濕化痰、止咳之功效,被收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥材(第1冊(cè))。近年來(lái),由于半夏資源短缺,臨床上常將水半夏作為半夏的代用品使用。既往文獻(xiàn)報(bào)道兩者在性狀、臨床功效、藥理作用、化學(xué)成分種類及含量多少和毒性大小方面均存在一定差異。生物堿類和有機(jī)酸類成分作為半夏主要功效成分,同時(shí)也可能是其產(chǎn)生毒性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。為初步鎖定半夏毒性物質(zhì)基礎(chǔ),加強(qiáng)半夏臨床用藥安全性與合理性,首先要從基原這個(gè)中藥特有因素對(duì)半夏毒性的影響入手,探討生物堿類和有機(jī)酸類成分含量與毒性大小相關(guān)性。為此,本實(shí)驗(yàn)采用酸性染料比色法和酸堿滴定法對(duì)半夏、水半夏總生物堿和總有機(jī)酸含量進(jìn)行了測(cè)定,并且建立了HPLC的檢測(cè)方法,對(duì)半夏、水半夏中的麻黃堿、鳥(niǎo)苷及琥珀酸含量進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)對(duì)半夏、水半夏藥材的急性毒性大小進(jìn)行了對(duì)比研究。1試驗(yàn)材料1.1藥物篩選、粉碎半夏(RhizomaPinelliae)、水半夏(RhizomaTyphoniFlagelliformis)均購(gòu)自河北省安國(guó)藥材批發(fā)市場(chǎng),供樣批號(hào)均為:20081003,粉碎,過(guò)40目藥物篩,備用。1.2生品混懸液的配制取半夏、水半夏藥材粉碎,過(guò)120目藥物篩,用蒸餾水配成生藥量分別為0.29g/mL、0.32g/mL的生品混懸液。供急性毒性實(shí)驗(yàn)用樣品。1.3試驗(yàn)對(duì)象動(dòng)物昆明種健康小白鼠,雌雄各半,體重18~22g,共60只,購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):scxk(魯)20030004號(hào)。1.4實(shí)驗(yàn)試劑和標(biāo)準(zhǔn)品紫外分光光度計(jì)(島津UV-265FW)、高效液相色譜儀(SSI,美國(guó)科學(xué)系統(tǒng)公司)及紫外檢測(cè)器、電子天平(梅特勒)等;琥珀酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠,純度不少于99.5%,批號(hào):081112);鹽酸麻黃堿(中國(guó)生物制品檢定所);鳥(niǎo)苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)生物制品檢定所);高效液相色譜法所用試劑均為色譜純,乙醇、無(wú)水乙醇、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、酚酞、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、鹽酸、溴麝香草酚藍(lán)等均為分析純。2半夏主要化學(xué)成分測(cè)定及結(jié)果2.1總氨基酸含量的測(cè)定2.1.1對(duì)照對(duì)照溶液的制備精密取1mL氯仿溶液于分液漏斗中,加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)10mL,新配0.1%溴麝香草酚藍(lán)溶液1mL,振蕩,分取氯仿層作為對(duì)照溶液。2.1.2供試液的制備取已粉碎的半夏、水半夏樣品,精密稱取2.5g,加氨水1mL,氯仿40mL,冷浸2h,水浴回流5h,過(guò)濾,合并濾液,定容于50mL容量瓶中,精密吸取該供試液1mL至60mL分液漏斗中,加氯仿9mL,檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)10mL,新配0.1%溴麝香草酚藍(lán)溶液1mL,振蕩,分取氯仿層作為供試液。2.1.3重量測(cè)定2.2麻黃堿含量的測(cè)定2.2.1流動(dòng)相、流速和室溫度十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(250×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇:0.08%三乙胺水溶液(18:82);流速:1.0mL/min;室溫(23℃);檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。2.2.2對(duì)照溶液的制備2.2.3試驗(yàn)溶液的制備取已粉碎的半夏、水半夏樣品,精密稱定2.5g,10倍量水加熱回流提取3次,1h/次,過(guò)濾,合并濾液,濃縮,定容至100mL,即得。2.2.4重量測(cè)定在以上色譜條件下,精密量取20μL對(duì)照品及供試品分別注入高效液相色譜儀中,記錄峰面積,進(jìn)行含量測(cè)定(表1)。2.3測(cè)定鳥(niǎo)類含量的測(cè)定2.3.1流動(dòng)相、溫度十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(150×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇:水:冰乙酸(5:95:0.01);流速:0.8ml/min;室溫(23℃);檢測(cè)波長(zhǎng):254nm。2.3.2對(duì)照溶液的制備2.3.3提取液的制備取已粉碎的半夏、水半夏樣品,精密稱定2.5g,10倍量水加熱回流提取3次,每次1小時(shí),過(guò)濾,合并濾液,濃縮,定容至100mL,即得。2.3.4重量測(cè)定在以上色譜條件下,精密量取20μL對(duì)照品及供試品分別注入高效液相色譜儀中,記錄峰面積,進(jìn)行含量測(cè)定(表1)。2.4總酸含量的測(cè)定2.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取琥珀酸0.5012g,75%乙醇溶解,定容于500mL容量瓶中,得1.0024mg/mL琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,備用。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)液消耗量測(cè)定精密吸取標(biāo)琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、5、7mL至200mL燒杯中,加乙醇至20mL,滴加1%酚酞溶液2滴,以氫氧化鈉滴定液滴定至微紅且30秒不退色為終點(diǎn),記錄氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的消耗量;以氫氧化鈉滴定液消耗體積為縱坐標(biāo),琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為橫坐標(biāo),求得回歸方程為:Y=3.3319x-0.3948,R2=0.998(n=5),表明琥珀酸在1.0024-7.0168mg范圍內(nèi)與氫氧化鈉滴定液消耗量呈良好線性關(guān)系。2.4.3提取液的制備取已粉碎的半夏、水半夏樣品,精密稱定2.5g,10倍量水加熱回流提取3次,每次1小時(shí),過(guò)濾,合并濾液,濃縮,定容至100mL,即得。2.4.4總有機(jī)酸含量測(cè)定精密吸取各供試品溶液15mL于200mL燒杯中,滴加1%酚酞溶液2滴,用標(biāo)定的NaOH溶液滴定至微紅且30秒不退色為終點(diǎn),記錄氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的消耗量,計(jì)算總有機(jī)酸含量(表1)。2.5為測(cè)定酚酸含量而測(cè)定2.5.1流動(dòng)相柱溫度十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(250×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:磷酸鹽緩沖液(pH=2.5)流速:1.0mL/min;柱溫(40℃);檢測(cè)波長(zhǎng):210nm。2.5.2對(duì)照溶液的制備2.5.3提取液的制備取已粉碎的半夏、水半夏樣品,精密稱定2.5g,10倍量水加熱回流提取3次,每次1小時(shí),過(guò)濾,合并濾液,濃縮,定容至100mL,即得。2.5.4堿土中總滲透劑和總從子研究一在以上色譜條件下,精密量取20μL對(duì)照品及供試品分別注入高效液相色譜儀中,記錄峰面積,進(jìn)行含量測(cè)定(表1)。表1數(shù)據(jù)表明,半夏、水半夏中總生物堿和鳥(niǎo)苷含量大小為:半夏>水半夏,麻黃堿含量為水半夏>半夏;總有機(jī)酸和琥珀酸含量大小為:半夏>水半夏。3急毒試驗(yàn)及結(jié)果按照急性毒性試驗(yàn)要求進(jìn)行預(yù)試,發(fā)現(xiàn)半夏、水半夏藥材生品混懸液無(wú)法測(cè)出LD50和MTD,故進(jìn)行一日內(nèi)最大給藥量(MLD)試驗(yàn)。取上述小鼠60只,禁食12小時(shí)后按體重隨機(jī)分為半夏藥材組、水半夏藥材組和水對(duì)照組,每組20只。半夏藥材組給含生藥量0.29g/mL的生品混懸液,按0.4ml/10g鼠重灌胃,每日3次,使1日內(nèi)給藥劑量達(dá)34.8g/kg,水半夏藥材組給含生藥量0.32g/mL的生品混懸液,按0.4ml/10g鼠重灌胃,每日3次,使1日內(nèi)給藥劑量達(dá)38.4g/kg,空白對(duì)照組給等體積的水。給藥后,藥物組小鼠于灌胃后5min見(jiàn)有煩躁,15min轉(zhuǎn)為安靜怠動(dòng),2~4h見(jiàn)有腹瀉,毛色無(wú)光,未見(jiàn)其他異常表現(xiàn)。給藥2天后,藥物組逐漸好轉(zhuǎn),藥后第7天,行為活動(dòng)正常,無(wú)異常病理性神經(jīng)反射出現(xiàn),進(jìn)食正常好,未見(jiàn)其他異常表現(xiàn),給藥組小鼠每日體重均與水對(duì)照組進(jìn)行組間t檢驗(yàn),體重變化數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。對(duì)照組與給藥組小鼠在急毒試驗(yàn)期內(nèi),體重自身差異見(jiàn)圖1。表2數(shù)據(jù)表明,給藥前半夏、水半夏組小鼠和水對(duì)照組小鼠體重?zé)o顯著性差異,給藥后1~2天半夏、水半夏組小鼠體重明顯低于水對(duì)照組,組間統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分別有非常顯著性差異和顯著性差異;給藥后3~5天半夏、水半夏組小鼠體重明顯低于水對(duì)照組,組間統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分別有顯著性差異,給藥后第6天起,水半夏組小鼠體重逐漸恢復(fù),給藥后第7天起,半夏組小鼠體重也逐漸恢復(fù);實(shí)驗(yàn)結(jié)束后半夏、水半夏組小鼠體重與水對(duì)照組小鼠體重比較無(wú)顯著性差異,且無(wú)一動(dòng)物死亡。由圖1看出,空白組和藥物組小鼠體重均有所增加,給藥后1~7天藥物組小鼠體重與空白組小鼠比較增加緩慢,且半夏組小鼠體重增加較水半夏組小鼠緩慢。4刑事法學(xué)和臨床質(zhì)量考察其基原為爭(zhēng)議的晚代藥和急性毒性的含量,其與水廢半夏始載于《本經(jīng)》被列為下品。陶弘景在《本草經(jīng)集注》中明確指出:“半夏有毒,令滑不盡,不爾戟人咽喉?！爆F(xiàn)代臨床應(yīng)用的不良反應(yīng)主要集中表現(xiàn)為對(duì)口腔、咽喉、食道及胃腸道黏膜的刺激作用及神經(jīng)系統(tǒng)毒性。其產(chǎn)生毒副作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確,且近年來(lái)半夏臨床應(yīng)用混亂品種情況嚴(yán)重,很大程度上影響了半夏臨床用藥的安全性?；鳛橹兴幪赜幸蛩赜绊懼兴幍幕瘜W(xué)成分種類和含量、功效、藥理作用和毒性大小。為探索半夏產(chǎn)生毒性作用的物質(zhì)基礎(chǔ),有必要對(duì)不同基原的半夏藥材的主要藥學(xué)(毒效)成分含量和急性毒性大小進(jìn)行比較研究,同時(shí)探討成分與毒性間相關(guān)性,以期為半夏及其代用品在臨床合理安全應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。本研究表明,1日內(nèi)給小鼠灌胃半夏藥材按含生藥量來(lái)計(jì)算34.8g/kg時(shí)和水半夏藥材按含生藥量來(lái)計(jì)算38.4g/kg時(shí),連續(xù)觀察14天,仍無(wú)一死亡,分別相當(dāng)于臨床成人每公斤體重日用量的270.7倍和298.7倍以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,半夏、水半夏有機(jī)酸類和生物堿類成分含量不同,總有機(jī)酸含量大小為:半夏>水半夏,琥珀酸含量為半夏>水半夏。半夏、水半夏中總生物堿含量大小為:半夏>水半夏,麻黃堿含量為水半夏>半夏,鳥(niǎo)苷含量為半夏>水半夏。且半夏毒性大于水半夏。初步提示半夏基原不同,其主要化學(xué)成分含量和毒性大小不同,而且其毒性大小與總生物堿和總有機(jī)酸含量有一定的相關(guān)性,生物堿和有機(jī)酸可能是半夏產(chǎn)生毒性作用