轉(zhuǎn)基因番茄植株中通過(guò)細(xì)菌酶的表達(dá)調(diào)控乙烯合成

轉(zhuǎn)基因番茄植株中通過(guò)細(xì)菌酶的表達(dá)調(diào)控乙烯合成摘要：乙烯，作為一種植物激素，其合成對(duì)于植物的多種發(fā)育過(guò)程是至關(guān)重要的。乙烯對(duì)于躍變型果實(shí)和蔬菜成熟過(guò)程的調(diào)控是其中最具特點(diǎn)的。降低乙烯合成的方法之一是調(diào)控乙烯的直接前體物質(zhì)，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）。土壤細(xì)菌中含有一種酶，稱為ACC脫氨酶，這種酶可以使土壤細(xì)菌把ACC作為唯一氮源而生長(zhǎng)。編碼ACC脫氨酶的基因已被成功轉(zhuǎn)入番茄植株。轉(zhuǎn)基因植株中乙烯合成的降低沒(méi)有引起任何植物表征的改變。但是，這些轉(zhuǎn)基因植株結(jié)出的果實(shí)在成熟過(guò)程中卻存在明顯的延遲，而且，已經(jīng)成熟的果實(shí)較沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的植株果實(shí)會(huì)出現(xiàn)至少六周或者更長(zhǎng)的時(shí)間才能軟化。這些結(jié)果都表明，ACC脫氨酶對(duì)于檢驗(yàn)乙烯在植物諸多發(fā)育過(guò)程和應(yīng)急過(guò)程具有重要作用，同時(shí)還可以檢驗(yàn)對(duì)那些被乙烯調(diào)控成熟的過(guò)程的果實(shí)和蔬菜的保質(zhì)期的影響。引言乙烯是一種強(qiáng)有力的植物生長(zhǎng)調(diào)控因子，影響多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，包括果實(shí)的成熟，衰老，以及應(yīng)激反應(yīng)。尤其是在躍變型果實(shí)的成熟過(guò)程中具有重要作用。乙烯合成和作用的化學(xué)抑制劑會(huì)使多種植物物種的果實(shí)成熟及花的衰老過(guò)程完全停止。在分子水平上，乙烯被認(rèn)為是能夠誘導(dǎo)許多基因的表達(dá)，其中包括成熟和病原體反應(yīng)過(guò)程中涉及的基因。乙烯從S-腺苷甲硫氨酸通過(guò)中間物質(zhì)ACC進(jìn)而合成得到。近期，編碼ACC合成酶和ACC氧化酶的cDNA克隆成功。這些后來(lái)的基因的cDNA反向表達(dá)就會(huì)導(dǎo)致乙烯合成的減少和減慢離體的番茄果實(shí)的成熟。在植物中，對(duì)于乙烯合成抑制的效力，要去除外源性功能作用以及其他化學(xué)抑制劑的攝取，應(yīng)該允許確定的實(shí)驗(yàn)可以闡明乙烯在不同發(fā)育過(guò)程和應(yīng)激反應(yīng)現(xiàn)象中起的精確作用。在這里我們提供了一套系統(tǒng)來(lái)顯示生長(zhǎng)和生殖組織中的乙烯合成的下降，并描述其在番茄果實(shí)成熟過(guò)程中的影響。結(jié)論對(duì)于ACC降解酶的克隆阻止乙烯合成的方法一般來(lái)說(shuō)包括將乙烯前體，ACC，不可逆地降解，轉(zhuǎn)化成非活性的復(fù)合物。目前，對(duì)于乙烯在植物體中的生物合成的認(rèn)識(shí)指出，ACC是生理?xiàng)l件下乙烯合成過(guò)程的中間代謝前體。除了乙烯生物合成途徑外，只有兩種ACC的代謝反應(yīng)是已知的。一種從土壤細(xì)菌，Pseudomonassp菌株ACPC中分離出來(lái)的，可以將ACC轉(zhuǎn)化為a-丁酮酸的酶，另一種酶實(shí)在植物體中發(fā)現(xiàn)，可以將ACC?；杀CC。我們通過(guò)以最小中間產(chǎn)物ACC作為唯一氮源的情況下，機(jī)體的生長(zhǎng)能力為指標(biāo)，對(duì)具有ACC降解酶的近600種土壤細(xì)菌進(jìn)行了篩選。其中，兩種細(xì)菌從篩選對(duì)象中分離，并進(jìn)一步鑒定。經(jīng)過(guò)鑒定，均為Pseudomonas種。我們選擇了其中之一的Pseudomonassp菌株6G5做進(jìn)一步鑒定。黏粒文庫(kù)依據(jù)基因組DNA建立并轉(zhuǎn)入E.coil中。具有黏粒的E.coil細(xì)胞依據(jù)它們以ACC作為唯一氮源時(shí)的生長(zhǎng)能力來(lái)進(jìn)行篩選。一些被分離出來(lái)，18種被進(jìn)一步測(cè)定。限制性內(nèi)切酶降解模式指出，所有的黏粒克隆都包含一個(gè)6G5基因組的重疊區(qū)域。隨后的亞克隆以及針對(duì)ACC作為中間產(chǎn)物最小劑量的生長(zhǎng)情況的篩選，他們使用一個(gè)包含ACC降解酶基因的2.4kb的DNA片段。這個(gè)片段是基于DNA測(cè)序分析得出，顯示出一個(gè)1017個(gè)核苷酸的單一開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)分子量36800的蛋白質(zhì)分子，如圖一所示。ACC降解酶的測(cè)定因?yàn)锳CC降解酶的活性在先前的文件中已經(jīng)有報(bào)道，依據(jù)此性質(zhì)，就可以確定克隆基因中是否編碼了ACC降解酶的序列。E.coli中6G5開(kāi)放閱讀框也是被設(shè)計(jì)成高水平表達(dá)的。圖2中的第二欄表示E.coli中爬M啟動(dòng)子調(diào)控下的基因表達(dá)情況?？梢钥闯稣_大小的蛋白被表達(dá)出來(lái)。細(xì)菌表達(dá)這種蛋白，就顯示其具有將ACC降解為等摩爾的氨和a-丁酮酸的能力。為了確定6G5蛋白的存在，必須獲得早前已經(jīng)鑒定過(guò)的有機(jī)體，Pseudomonassp菌株ACPC，利用該有機(jī)體產(chǎn)生的ACC降解酶進(jìn)行純化，并且與已公布的標(biāo)準(zhǔn)做同質(zhì)性檢測(cè)。該蛋白經(jīng)過(guò)氨基端氨基酸測(cè)序，前21個(gè)氨基酸已經(jīng)確定。這21個(gè)氨基酸種的17個(gè)與預(yù)測(cè)的6G5序列表達(dá)出來(lái)的氨基酸是一致的，剩下不同的4個(gè)氨基酸中的2個(gè)是保守性的替換。因此6G5序列是編碼ACC降解酶的。先前報(bào)道中，有活性的ACC降解酶的分子量為104000，而預(yù)測(cè)的亞單位的分子量為36800，可以推測(cè)該酶是以三聚體的形式存在的。植物體中ACC降解酶的表達(dá)ACC降解酶基因被放置在花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動(dòng)子之后，并受其調(diào)控，該基因用來(lái)轉(zhuǎn)化UC82B番茄植株。然而，CaMV的35S啟動(dòng)子會(huì)在特定的組織中優(yōu)先表達(dá)，在大部分的組織中，啟動(dòng)子會(huì)表達(dá)出可檢測(cè)的水平。因?yàn)橐蚁﹨⑴c多種植物生理反應(yīng)，因此當(dāng)植物體內(nèi)對(duì)于乙烯的抑制時(shí)，可能會(huì)極大程度影響植物生長(zhǎng)過(guò)程。然而，有一些的表現(xiàn)性正常的轉(zhuǎn)基因植株可以從這些轉(zhuǎn)化體中篩選出來(lái)。如圖2所示，為植物組織中酶蛋白的印記雜交分析，結(jié)果表明，這些植株中很多能夠高水平表達(dá)ACC降解酶的基因，產(chǎn)物量超過(guò)總蛋白的0.5%。植物體的新葉組織中ACC降解酶表達(dá)最高的兩個(gè)通道被用作乙烯生成分析。如表1所示，ACC降解蛋白表達(dá)最高的通道，5673，乙烯生成量降低了90%。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，這條通道顯示出更高的效力，乙烯生成量的降幅達(dá)到97%。在ACC降解蛋白表達(dá)次高的通道，5854中，乙烯的降幅也達(dá)到了78%。這些數(shù)據(jù)都是由基因表達(dá)數(shù)據(jù)組合而成的?；谟∮浄磻?yīng)的數(shù)據(jù)，5673通道的ACC降解酶包含了大約0.5%的可溶性蛋白，而5854包含了大約0.05%。純和植株5673根據(jù)其表型效應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因植株獲得的種子正常發(fā)芽，長(zhǎng)出的植株與對(duì)照組在表型上并沒(méi)有什么區(qū)別。同時(shí)，植株在花期和成熟期并沒(méi)有出現(xiàn)延遲的情況，然而，他們卻在成熟的過(guò)程上有著明顯的不同。圖3所示為，植株5673和UC82B的果實(shí)雖然在3天的時(shí)候乙烯的量都達(dá)到了峰值，但是5673果實(shí)的乙烯合成水平僅是UC28B的10%。表2和圖4都表明了采摘后在破色期的果實(shí)延遲成熟的情況。對(duì)照組的果實(shí)經(jīng)過(guò)7天從破色期到紅熟期，僅僅2周后就出現(xiàn)明顯的軟爛。轉(zhuǎn)基因組的果實(shí)經(jīng)過(guò)24天后達(dá)到紅熟期，并且在很長(zhǎng)一段時(shí)間保持果實(shí)硬實(shí)。圖4A圖示在破色期摘下的果實(shí)，并將其放在室溫下7天讓其成熟。圖4B圖示了在破色期就摘下，室溫儲(chǔ)存4個(gè)月的果實(shí)過(guò)分成熟的的情況，而這種果實(shí)是有ACC降解酶表達(dá)的。圖4C則圖示了在植株上生長(zhǎng)成熟的果實(shí)在同樣條件下的情況。轉(zhuǎn)基因的果實(shí)在超過(guò)40天的生長(zhǎng)下仍然硬實(shí)并且沒(méi)有脫落，而對(duì)照組的果實(shí)14天就脫落。討論乙烯是已知的可以促進(jìn)躍變型果實(shí)成熟的因素，并且是由ACC轉(zhuǎn)化合成。因?yàn)锳CC是目前已知參與到乙烯合成代謝途徑的物質(zhì)，所以，ACC的降解可能是乙烯合成過(guò)程中唯一起著生物化學(xué)上具有重要的抑制作用。可能是因?yàn)樗ダ辖M織中具有大量的ACC以及其代謝物丙二酰-ACC，因此具有降解ACC能力的微生物很容易從土壤中分離出來(lái)。我們?cè)谒拇笾瞢@得的樣本中獨(dú)立分離出來(lái)具有ACC降解酶的細(xì)菌。這些分離的基因轉(zhuǎn)入番茄植株并表達(dá)，使得乙烯的產(chǎn)量大大降低。ACC的降解產(chǎn)物a-丁酮酸自然出現(xiàn)在植物體中。a-丁酮酸是乙酰乳糖合成酶的底物，因此a-丁酮酸在植物體中可以被轉(zhuǎn)化成氨基酸側(cè)鏈。很有意思的是，實(shí)驗(yàn)組一些組織，例如，葉片和果實(shí)中的乙烯合成量大幅減少，這種現(xiàn)象除了正在成熟的果實(shí)中外，與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差別。這些結(jié)果證明了直到果實(shí)成熟之前，乙烯在植物生長(zhǎng)中起到的作用不大。這也說(shuō)明，轉(zhuǎn)基因植株中持續(xù)合成的乙烯對(duì)于一般番茄的生長(zhǎng)也是足夠的。在實(shí)驗(yàn)室條件下，擬南芥的一種表形正常但對(duì)乙烯不敏感的突變的存在，證明了，乙烯對(duì)于植株的作用與實(shí)驗(yàn)組直到果實(shí)成熟之前，乙烯在植物生長(zhǎng)中起到的作用不大的情況一致。相反地，乙烯似乎是環(huán)境或生理?xiàng)l件改變至關(guān)重要的信號(hào)，例如在果實(shí)成熟期或者應(yīng)急反應(yīng)中。在這種情況下，環(huán)境對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)微差別是無(wú)法去除的。另一種減少乙烯合成的方法，包括一種反轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致這種內(nèi)源性的生物合成途徑關(guān)閉。這種方法已經(jīng)被證明能夠有效延遲果實(shí)的成熟。因?yàn)锳CC合成酶與ACC氧化酶都是多基因家族，每種酶的表達(dá)都是有嚴(yán)格的時(shí)效性和空間性，很難評(píng)價(jià)在不同器官中對(duì)于乙烯合成的抑制的效用。本文中所提及的方式是可以在植株各個(gè)部位減少乙烯合成的。此外，ACC脫氨酶通常用作乙烯在抗病性、環(huán)境應(yīng)激性以及發(fā)育等方面所起作用的研究。在表達(dá)編碼ACC脫氨酶的基因的轉(zhuǎn)基因番茄中，乙烯的抑制效用和成熟過(guò)程的延遲之間存在一定聯(lián)系。對(duì)于儲(chǔ)存在室溫下的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的直觀觀察也表面，軟化過(guò)程存在著明顯的延遲，果實(shí)較對(duì)照組保持堅(jiān)硬要長(zhǎng)五個(gè)月。在同樣的時(shí)間，如圖4B所示，對(duì)照組果實(shí)早已完全干癟。ACC的降解會(huì)阻礙乙烯的合成，但是不會(huì)影響果實(shí)感知乙烯的能力，這好似因?yàn)?，轉(zhuǎn)基因果實(shí)一般是暴露于外源性乙烯中催熟的。所有這些因素表明，ACC脫氨酶會(huì)會(huì)使得番茄或其他躍變果實(shí)和蔬菜顯著延長(zhǎng)儲(chǔ)存期。方法微生物的篩選對(duì)保存的600種細(xì)菌菌株依據(jù)其分解ACC的能力進(jìn)行篩選。大部分的微生物都是具有熒光的Pseudomonas種，剩下的微生物在土壤中很據(jù)代表性。篩選是設(shè)計(jì)成選擇那些在ACC作為唯一氮源，濃度只有3.0mM的最小值仍然可以生長(zhǎng)的微生物。樣品在96孔微量板30°C條件下培養(yǎng)4天。每個(gè)孔中包含0.2mLDF鹽溶液，該溶液除去其他氮源，只保留ACC，含0.2%葡萄糖、0.2%葡萄糖酸、0.2%檸檬酸。篩選出來(lái)三種在含有ACC基質(zhì)中生長(zhǎng)的微生物。他們可以在含有ACC的基質(zhì)中生長(zhǎng)，這一現(xiàn)象通過(guò)將這些微生物再次在300mL同樣的液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)來(lái)證明。選擇在ACC基質(zhì)中生長(zhǎng)最好的兩個(gè)菌種，分別標(biāo)記為3F2和6G5,再做進(jìn)一步分離。為了準(zhǔn)備從Pseudomonassp菌株的6G5菌株中獲得染色體DNA，在LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，約200mL。將這些細(xì)胞收集起來(lái)，并重懸于10mL由25mMTris-HCl、pH為8、10mMEDTA所配成的溶液中。最后加入濃度為1%的SDS溶液，將此懸浮液進(jìn)行三次冷凍溶解循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括，將懸浮液放入干冰15分鐘，再放入70C水浴10分鐘。之后，用等體積的苯酚、氯仿將該溶解產(chǎn)物萃取4次，再用乙醇使其沉淀。沉淀物重懸于5mL由10mMTris、pH為7.5、1.0mMEDTA所配成的溶液中。6G5DNA被EcoRI部分分解，根據(jù)其大小分離在10%?40%的蔗糖濃度梯度溶液中。包含超過(guò)20kbDNA片段的碎片都被匯集在一起。由EcoRI切的pMON17016片段構(gòu)成黏粒庫(kù)，這個(gè)片段是黏粒載體 pHC79的衍生物。pMON17016質(zhì)粒中具有一個(gè)T7噬菌體中提出10啟動(dòng)子基因連接的克隆位點(diǎn)。黏粒文庫(kù)被轉(zhuǎn)入久噬菌體中，通過(guò)廠商加工，再被轉(zhuǎn)入￡^阮r，c加aco〃MM294。為了篩選具有ACC脫氨酶基因的黏?？寺?，將文庫(kù)在包含3mMACC作為唯一氮源的M9基質(zhì)上涂平板。將平板在37C條件下培養(yǎng)3天。大約56000個(gè)黏粒中的300個(gè)（每200中的一個(gè)）可以在平板上生長(zhǎng)。ACC脫氨酶的活性可以由其分解產(chǎn)物a-丁酮酸及氨的含量來(lái)測(cè)定。a-丁酮酸通過(guò)2,4-二硝基苯肼的衍生物來(lái)測(cè)定。氨通過(guò)谷氨酸脫氫酶測(cè)定工具來(lái)測(cè)定，該工具由Sigma公司出品。a-丁酮酸是通過(guò)反相離子高效液相色譜將固定相與其共洗脫來(lái)確定。檢測(cè)的混合物需要用乙酸乙酯萃取2次，并棄水相。乙酸乙酯部分再用10%碳酸鈉萃取，并將得到的水相直接加入C-18層析柱。樣品在同等條件下用60%的甲醇，1.5%乙酸和1.0mM的四丁胺磷酸作為離子配對(duì)劑進(jìn)行洗脫。洗脫物用分光光度計(jì)在374nm下檢測(cè)。一個(gè)長(zhǎng)度為10.6kb的BamHI-Xbal片段包含ACC脫氨酶活性，此片段從一個(gè)黏粒中亞克隆并轉(zhuǎn)入pUC118中。隨后通過(guò)HindIII和Smal切割，將具ACC酶活性的片段長(zhǎng)度縮小至2.4kb。這條鏈通過(guò)美國(guó)生物化學(xué)公司DNA測(cè)序工具進(jìn)行測(cè)序，一個(gè)長(zhǎng)1017bp的ACC脫氨酶基因的開(kāi)放閱讀框被分離出來(lái)。蛋白質(zhì)測(cè)序純化過(guò)的ACC脫氨酶利用埃德曼分解法進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序，測(cè)序儀器為應(yīng)用生物系統(tǒng)470A蛋白質(zhì)測(cè)序儀。細(xì)菌基因的表達(dá)和抗體的制備Ndel位點(diǎn)是在ATG起始位點(diǎn)上引進(jìn)的由ACC脫氨酶開(kāi)放閱讀框直接誘變得到的。這個(gè)基因被亞克隆為一段1127bp的Ndel-Hindlll片段，并轉(zhuǎn)入E.coli表達(dá)載體中，該載體包含recA啟動(dòng)子和基因10前導(dǎo)序列。這個(gè)質(zhì)粒，pMON10078，被轉(zhuǎn)入E.coliW3110中，并置于50pg/mL的萘啶酸中，37°C培養(yǎng)20小時(shí)，使基因表達(dá)。細(xì)胞顆粒進(jìn)行再懸和超聲波處理1分鐘，使可溶性和不可溶性的片段在10%?20%的變性膠進(jìn)行跑膠。最大的條帶的分子量大約37000，聯(lián)系到我們預(yù)測(cè)的ACC脫氨酶的分類為36800，條帶出現(xiàn)在不溶性的部分。樣品依據(jù)其氨基末端的氨基酸序列測(cè)定。用1.5mg蛋白感染山羊來(lái)得到抗體。ACC脫氨酶在番茄內(nèi)的表達(dá)一個(gè)從pMON10027質(zhì)粒中提取的，長(zhǎng)度為1071bp，含有ACC脫羧酶開(kāi)放閱讀框的EcoRv-Sacl片段，被克隆到轉(zhuǎn)運(yùn)載體pMON893中。這個(gè)過(guò)程講開(kāi)放閱讀框添加到復(fù)制的CaMC35S啟動(dòng)子上和豌豆的rbcS-E9基因3’末端。這個(gè)質(zhì)粒載體利用協(xié)助質(zhì)粒pRK2013通過(guò)三親本聯(lián)合體