酵母多糖的分離提取

實(shí)驗(yàn)?zāi)康某醪搅私馕⑸锇舛嗵堑母拍?。學(xué)習(xí)并掌握顯微操作技術(shù)及無菌操作技術(shù)。掌握酵母菌株的搖瓶液體發(fā)酵技術(shù)。學(xué)習(xí)微生物胞外多糖分離提取及測(cè)定的基本方法。實(shí)驗(yàn)流程菌株活化一液體種子培養(yǎng)一液體發(fā)酵培養(yǎng)一過程監(jiān)測(cè)（形態(tài)、生物量、Ph、產(chǎn)物）產(chǎn)物分離提?。ㄉ锨?、菌體）培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)材料菌株：酵母菌試劑：葡萄糖（AR）、酵母粉（BR）、蛋白胨（BR）、硫酸銨（AR）、丙三醇（AR）、KH2PO4（AR）、MgSO."（AR）、3,5-二硝基水楊酸（CP）、NaOH（AR）、KOH（AR）。儀器設(shè)備：電熱恒溫培養(yǎng)箱、數(shù)顯恒溫?fù)u床、壓力蒸汽滅菌鍋、低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、電子精密天平、Ph數(shù)顯酸度計(jì)、電子恒溫水浴鍋、可見分光光度計(jì)、電腦型生物顯微鏡、超凈工作臺(tái)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、氣相色譜儀。培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基：1%YeastExtract（酵母膏），2%Peptone（蛋白月東）,2%Dextrose（glucose）（葡萄糖），若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉。種子培養(yǎng)基。葡萄糖10g,蛋白東5g,酵母膏15g,氯化鈉4g,pH7.0?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。葡萄糖20g/L、硫酸銨8g/L、蛋白東5g/L、KH2P042.5g/L、MgSO47H200.5g/L。實(shí)驗(yàn)過程條件優(yōu)化及發(fā)酵培養(yǎng)菌株活化將保藏的菌株接種到固體平板培養(yǎng)。制備種子液進(jìn)行液體種子培養(yǎng)，向裝有150ml種子液體培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中接入平板上的種子，30°C、150r/min震蕩培養(yǎng)24h。發(fā)酵培養(yǎng)將活化好的種子液按培養(yǎng)條件的正交表接入100ml的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，通過測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果用于下一步的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。培養(yǎng)優(yōu)化培養(yǎng)基的優(yōu)化溫度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行三水平三因素正交實(shí)驗(yàn)無交互作用。溫度C接種量％培養(yǎng)時(shí)間h128104823015603322072培養(yǎng)條件的優(yōu)化酵母發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)由葡萄糖、硫酸銨、KH2P04以及MgS04組成發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基，根據(jù)之前試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)每種成分設(shè)定4種水平，進(jìn)行四因素四水平的正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)一步優(yōu)化，無交互作用。葡萄糖g/L硫酸銨g/LKHPO24MgSO411561.50.5220820.75325102.514301231.25發(fā)酵生產(chǎn)酵母多糖將優(yōu)化好的所有條件計(jì)算完成后按照優(yōu)化好的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件發(fā)酵生產(chǎn)酵母多糖共生產(chǎn)400ml。酵母多糖的分離提取及測(cè)定2.1.試劑氫氧化鉀、35%醋酸、95%乙醇、丙酮、乙醚。2.2.酵母胞壁多糖的提取工序提取工藝路線為：酵母懸液f凍融f超聲波破碎f堿溶f中和f沉淀f洗滌f烘干。1） 酵母溶解:取發(fā)酵后的菌液10ml,3000rmin離心10min，取沉淀，將沉淀溶解于25ml的容量瓶中。對(duì)上清液進(jìn)行測(cè)定如果其中存在多糖則直接用菌液破壁提取多糖。2） 凍融：將酵母沉淀置于-20°C下冷凍2h,再置于100°C水中驟然升溫使其融化，如此反復(fù)3次。3） 超聲波破碎：確定超聲波破碎時(shí)間和功率，破碎最佳工藝參數(shù)是功率400?500W.X作次數(shù)150次，超聲波開2s關(guān)1s。4） 堿溶：確定堿濃度、溫度、時(shí)間等條件，堿溶最佳工藝條件是堿液濃度3%、溫度100C、時(shí)間1.5h。5） 中和：室溫放冷，用醋酸中和至pH值為6?7,置于3500r/min離心機(jī)中離心10min，靜置，收集上清夜。6） 沉淀：以95%乙醇作沉淀劑，沉淀12h,乙醇與上清液的體積比為2:1。7） 洗滌：沉淀用丙酮洗滌2次，用乙醚洗滌1次。8） 烘干：30C下干燥12h。2.3.多糖的測(cè)定苯酚硫酸法2.3.1試劑a） 濃硫酸：分析純，95.5%b） 80%苯酚：80克苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光長期儲(chǔ)存。c） 6%苯酚：臨用前以80%苯酚配制。（每次測(cè)定均需現(xiàn)配）d） 標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia），或分析純葡萄糖。2.3.2操作a）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸餾水補(bǔ)至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻，沸水浴顯色15min以后于490nm測(cè)光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為多糖微克數(shù)，縱坐標(biāo)為光密度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。b）樣品含量測(cè)定稱取酵母粗多糖置20ml具塞試管中定容-