20222022學(xué)年高中生物選修一最新同步教學(xué)2

課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)課題背景尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。但尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當土壤中的細菌將尿素分解成氨后才能被植物利用。細菌能利用尿素的原因土壤中的細菌之所以能分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3NH3不能直接吸收，植物吸收其中的N是以NH4和NO3-形式吸收的。NH3的水溶性高，在水中形成NH4；土壤里的微生物如硝化細菌把NH3氧化為NO3-，然后以NO3-的形式被植物吸收。常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌研究思路（一）篩選菌株（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目（三）設(shè)置對照課題背景啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。PCR技術(shù)是一種常用的DNA擴增技術(shù)，此項技術(shù)的自動化，需要使用耐高溫的DNA聚合酶，如果請你來找這種耐高溫的酶，你會去哪里找？熱泉70-80攝氏度的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物，而耐熱的Taq細菌脫穎而出。水生耐熱細菌Taq（一）篩選菌株4一、研究思路1、實驗室微生物的篩選原理人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。（一）篩選菌株2、選擇培養(yǎng)基在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。加入青霉素的培養(yǎng)基——細菌不生長，酵母菌、霉菌等真菌能生長5一、研究思路（1）在培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是是什么物質(zhì)？碳源是葡萄糖和尿素，氮源是尿素（2）分析該配方的培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果有，又是如何進行選擇的？有篩選作用。尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。3、分離尿素分解菌的選擇培養(yǎng)基（一）篩選菌株6一、研究思路1mm（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目1、顯微鏡直接計數(shù)法①不能區(qū)分死菌與活菌；②不適于對運動細菌的計數(shù)；③個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察缺點7一、研究思路利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。a不能區(qū)分死菌與活菌；b不適于對運動細菌的計數(shù)；c需要相對高的細菌濃度；d個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點一、研究思路（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目1、顯微鏡直接計數(shù)法一、研究思路2、活菌計數(shù)法——統(tǒng)計菌落數(shù)目（稀釋涂布平板法）（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目9一、研究思路3稀釋涂布平板法在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。原理：恰當?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準確，通常將幾個稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。一、研究思路（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目每克樣品中的菌落數(shù)＝C÷V×MC代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積ml，M代表稀釋倍數(shù)。2稀釋涂布平板法一、研究思路（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目①為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低？注意事項當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。一、研究思路排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。二、研究思路設(shè)置對照的主要目的是：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。原因：⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤或者是混入了其他的含氮物質(zhì)實例：一、研究思路（三）設(shè)置對照小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進行實驗方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。一、研究思路（三）設(shè)置對照（一）土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。（二）制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。二、實驗設(shè)計

由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。

準備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（作對照）。還需要8個滅菌試管和1個滅菌移液管。

將稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。（三）、樣品的稀釋二、實驗設(shè)計◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計數(shù)的平板二、實驗設(shè)計（三）、樣品的稀釋注意：實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30—300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大表明試驗不精確，需要重新實驗。（四）、取樣涂布二、實驗設(shè)計注意事項——實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)日期、稀釋度等。三、實驗操作注意事項（四）、取樣涂布高濃度→低濃度，換槍頭低濃度→高濃度，可不用換槍頭三、實驗操作注意事項（四）、取樣涂布三、實驗操作注意事項如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30—300的平板，則說明稀釋操作比較成功，可以對菌落進行計數(shù)。記細菌：30～37℃；1～2d霉菌：25～28℃；3～4d放線菌：25～28℃；5～7d

1培養(yǎng)：2觀察與計數(shù)：一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。記（五）、培養(yǎng)和觀察在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。微生物的培養(yǎng)與觀察1、結(jié)合對照，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。2、是否獲得了某一稀釋度下，菌落數(shù)目在30——300的平板。在這稀釋度下，是否至少有兩個平板的菌落數(shù)相近？3、你統(tǒng)計的每克土壤中含有能分解尿素的細菌的菌落數(shù)是多少？與其他同學(xué)的結(jié)果接近嗎？如果差異很大，可能是什么原因引起的？24四、結(jié)果分析與評價土樣涂布在選擇培養(yǎng)基分解尿素的細菌菌落鑒別培養(yǎng)基分解尿素的細菌鑒定分解尿素的菌體能合成脲酶，可將尿素分解為氨。氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，PH升高。通過檢測培養(yǎng)基的PH變化來判斷。理解在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。記五、課題延伸在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素本課題只是對能分解尿素的細菌進行了初步的篩選，只是分離純化菌種的第一步。對分離的菌種作進一步的鑒定，要借助生物化學(xué)的方法。CONH22H2OCO22NH3脲酶原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強→酚紅變紅五、課題延伸大腸桿菌呈深紫色,中心有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂EMB上典型特征【課堂小結(jié)】一、分離--選擇培養(yǎng)基的：分解尿素細菌的分離與計數(shù)尿素作為唯一的氮源。二、鑒定方法：在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變紅，pH升高，說明細菌能分解尿素。三、統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法（1）顯微鏡直接計數(shù)法（2）間接計數(shù)法（稀釋涂布平板計數(shù)法）①計算公式每克樣品中的菌株數(shù)＝C÷V×M②操作：設(shè)置重復(fù)組，選擇菌落數(shù)30～300的平板進行計數(shù)。四、設(shè)置對照①證明培養(yǎng)基未被污染---用空白培養(yǎng)基作對照（選擇培養(yǎng)基不接種土壤樣品）。②證明選擇培養(yǎng)基的選擇作用--對照組（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基接種等量同種菌液）1、下列能選擇出分解尿素細菌的培養(yǎng)基是AH2PO4、Na2HPO4、、葡萄糖、尿素、瓊脂、水BH2PO4、Na2HPO4、、葡萄糖、瓊脂、水CH2PO4、Na2HPO4、、尿素、瓊脂、水DH2PO4、Na2HPO4、、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、水1、下列能選擇出分解尿素細菌的培養(yǎng)基是AH2PO4、Na2HPO4、、葡萄糖、尿素、瓊脂、水BH2PO4、Na2HPO4、、葡萄糖、瓊脂、水CH2PO4、Na2HPO4、、尿素、瓊脂、水DH2PO4、Na2HPO4、、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、水A課后練習：2、下列是關(guān)于“檢測土壤中細菌總數(shù)”實驗操作的敘述，其中錯誤的是（）A用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B取104、105、，分別涂布于各組平板上C將實驗組和對照組平板倒置，37℃恒溫培養(yǎng)24-48小時D確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的實驗組平板進行計數(shù)D2、下列是關(guān)于“檢測土壤中細菌總數(shù)”實驗操作的敘述，其中錯誤的是（）A用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B取104、105、，分別涂布于各組平板上C將實驗組和對照組平板倒置，37℃恒溫培養(yǎng)24-48小時D確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的實驗組平板進行計數(shù)3、用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設(shè)置的對照是A未接種的選擇培養(yǎng)基B未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基C接種了的選擇培養(yǎng)基D接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基4、在本課題的實驗中，下列關(guān)于土壤取樣的敘述，錯誤的是（）A土壤取樣時應(yīng)選取肥沃、濕潤的土壤左右，再取樣C取樣用的小鐵鏟和信封在使用前不用滅菌D應(yīng)在火焰旁邊稱取土壤DC課后練習：4能夠測定樣品活菌數(shù)的方法是A稀釋涂布平板法B直接計數(shù)法C重量法D比濁法5下列關(guān)于微生物分離和培養(yǎng)的敘述,錯誤的是A微生物培養(yǎng)前,需對培養(yǎng)基進行消毒B測定土壤樣品中的細菌數(shù)目,常用菌落計數(shù)法C分離土壤中不同的微生物,要采用不同的稀釋度D分離能分解尿素的細菌,要以尿素作為培養(yǎng)基中唯一的氮源AA課后練習：6、牛等牲畜的瘤胃中生活著許多以尿素作唯一氮源的微生物。某同學(xué)從剛宰殺的牛的瘤胃中取樣獲得菌液，并對能分解尿素的細菌進行分離、計數(shù)和鑒定。回答下列問題：（1